左归丸调控PI3K/AKT信号通路的研究进展*

叶凡,张舒怡,刘佳乐,李冯锐

1.包头医学院,内蒙古 包头 014000; 2.山东第二医科大学附属医院,山东 潍坊 261000

左归丸出自明代张景岳的《景岳全书·新方八阵》卷五十一,是滋阴补肾的代表方剂,此方由熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、川牛膝、菟丝子、鹿角胶及龟板胶组成,八药合用共奏滋阴补肾、填精益髓之功,主治真阴肾水不足,肝肾阴亏、精血不足、脑髓不充之证。左归丸作为经典古方近年来在神经系统疾病、生殖系统疾病、内分泌系统疾病及骨科疾病等方面的基础研究不断深入,其药理作用和对信号通路的调控及分子机制的研究亦取得一定进展。本文聚焦左归丸调控PI3K/AKT信号通路对疾病发挥防治作用的实验研究进行综述,以期为左归丸的基础研究提供思路及参考,并挖掘其潜在临床应用价值。

1 PI3K/AKT信号通路

PI3K/AKT信号通路存在于多种生物中,主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(proteinkinase B,PKB)及其下游分子组成[1]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,为p110催化亚基及p85调节亚基所组成的异源二聚体,具有SH2结构域,可因结合多种细胞因子磷酸化胞内段酪氨酸残基从而被激活[2]。在膜脂代谢中,具有磷脂酰肌醇激酶活性的PI3K催化PI-4-P(PIP)生成PI-3,4-P2(PIP2),再催化后者生成PI-3,4,5-P3(PIP3)。这些产物都是细胞内重要的第二信使,作用于PI3K/AKT通路,在细胞的增殖、凋亡、代谢等过程中起重要的作用[3-4]。PKB 又称AKT,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,也是PI3K信号通路的主要下游靶点。目前发现,在哺乳动物中AKT有三种亚型AKTl(PKBα)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)。AKT1主要参与调节细胞生长和分裂,AKT2在细胞能量和代谢中发挥重要作用,AKT3被认为对大脑发育和恶性胶质瘤细胞的存活至关重要[5]。在静息状态下,AKT以非活性状态存在于细胞质基质中。

当细胞受到内外源性刺激后,PI3K激活可导致几乎所有细胞和组织中的AKT活化,完全活化的AKT从细胞膜上解离下来,进入细胞质基质和细胞核,通过磷酸化AKT不同位点精准调控其下游靶蛋白,发挥不同的生物效应,主要包括调节细胞周期,促进细胞代谢、生长及增殖,抑制细胞凋亡,调节氧化应激、炎症反应及能量代谢等多种生物学过程[6-7]。

PI3K/AKT通路作为酶联受体介导的重要信号转导通路,主要依赖于下游B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)[8]、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)[9]、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)[10]、糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)[11]、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)[12]、叉头转录蛋白O(forkhead box O,FOXO)[13]等靶蛋白发挥生物学功能。

Bcl-2蛋白家族是一种主要存在于线粒体外膜上的完整膜蛋白[14],通过调控线粒体凋亡影响细胞存活与凋亡,Caspase-3具有蛋白失活和切割作用,激活后可促进细胞凋亡[10]。激活PI3K/AKT信号通路可上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达,磷酸化Caspase-3抑制其活性,发挥抗细胞凋亡作用[15];GSK3β是由轴蛋白(axis protein,Axin)、β-连环蛋白和腺瘤性结肠息肉病蛋白组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可磷酸化多种内源性蛋白和转录因子,参与糖稳态调控、细胞生长发育、肿瘤发生等过程[16],激活PI3K/AKT信号通路可抑制GSK3β蛋白表达并提升细胞活性,同时激活的AKT可磷酸化GSK3使其失活,减弱其对糖原合成酶的抑制作用从而促进糖原合成、促进细胞对葡萄糖的利用,降低血糖水平[17];mTOR是属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶 (PIKK)家族[18],在细胞生存、生长、增殖及运动中扮演着重要角色,并参与转录与蛋白质合成,激活PI3K/AKT信号通路,上调mTOR磷酸化水平,促进细胞的生长、增殖,被激活的mTOR可升高血管内皮生长因子的表达,促进血管生成[19];FoxO家族成员可调控氧化应激、细胞增殖、凋亡及分化[20],FoxO1作为转录调控因子,与糖脂代谢密切相关,激活PI3K/AKT通路,活化的AKT可磷酸化FoxO1,调控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的表达,抑制糖异生,促进糖酵解[17]。

2 左归丸基于PI3K/AKT信号通路对疾病的防治作用

2.1 神经系统疾病中医学理论提到肾为先天之本,《医学正传》曰：“肾元盛则寿延,肾元衰则寿夭。”肾藏精,而肾精化生髓通于脑,即肾之精气充满,则生髓足,脑髓得以滋养,脑的发育就会正常;反之,若肾精亏虚,则脑髓失养,会导致脑发育障碍[21]。肾对大脑功能的影响尤为重要,按照中医学理论对神经系统疾病的防治可从补肾生精、填精益髓入手。

2.1.1 痴呆及认知功能障碍相关疾病左归丸可抑制神经细胞凋亡并促进其生长发育,改善认知功能,提高学习记忆能力。张涛涛等[22]采用大鼠小脑颗粒神经元去极化建立细胞凋亡模型,观察左归丸水提液对细胞存活率、胞核形态学变化、DNA断裂特性的影响并探讨其改善痴呆症的分子机理,发现左归丸对低钾所致的神经元凋亡具有保护作用,此种保护作用可被PI3K抑制剂LY294002阻断,推断左归丸可通过调控PI3K/AKT信号通路而发挥抗神经元凋亡作用。在探究左归丸保护睡眠剥夺所致认知障碍的研究中,张颖等[23]发现左归丸治疗组大鼠海马组织中磷酸化PI3K(phosphorylated-PI3K,p-PI3K)、磷酸化AKT(phosphorylated-AKT,p-AKT)、Bcl-2表达均高于模型组,Bax、Caspase-3表达低于模型组,PI3K抑制剂可阻断左归丸上述作用,提示左归丸可激活PI3K/AKT信号通路,上调Bcl-2/Bax并抑制Caspase-3蛋白表达,减少睡眠剥夺所致的神经细胞凋亡,对认知功能损伤发挥保护作用。

在肾虚所致神经元功能异常的研究中,有研究者发现左归丸发挥抗凋亡、促进神经细胞活性的保护作用。Liu等[24]体外培养新生大鼠海马神经干细胞,采用左旋单钠谷氨酸模拟肾阴虚证模型,发现模型组神经干细胞增殖分化异常和细胞凋亡,进行左归丸干预后,总AKT、p-AKT(Ser473)及p-AKT(Thr308)水平高于模型组,GSK3β(Ser9)表达降低,PI3K抑制剂可反转上述改变,PI3K激动剂可增强上述变化,证实左归丸通过激活PI3K/AKT通路,抑制下游靶蛋白GSK3β表达,促进细胞存活,发挥对海马神经干细胞的抗凋亡作用。张小艳[25]以先天肾虚仔鼠模型为研究对象,在孕期行左归丸填补母鼠肾精,发现左归丸可间接升高仔鼠大脑皮质PI3K等相关因子表达,从而促进脑皮质发育并缓解仔鼠生长发育和学习记忆能力低下,左归丸主要通过影响ADAMTS-4剪切调控Reelin蛋白,进而调控PI3K/AKT信号通路来实现。

2.1.2 脑缺血再灌注损伤脑缺血再灌注损伤是一种严重的脑血管疾病,常伴有缺血性脑卒中、脑梗死[26]。左归丸通过抗细胞凋亡、缓解氧化应激和炎症反应发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。Liu等[27]分离大鼠神经干细胞并行氧糖剥夺及恢复诱导实验,分析左归丸对细胞活力和凋亡的影响,具体实验方法为,采用大脑中动脉闭塞再灌注法建立大鼠脑缺血再灌注模型,评估左归丸对神经功能、脑梗死面积和认知障碍的影响,发现左归丸可减弱氧糖剥夺和恢复所致的细胞活力下降和细胞凋亡,可减少大鼠神经损伤和梗死面积并提升认知能力。刘家峰等[28]研究发现,左归丸对脑缺血再灌注大鼠具有保护作用,并发现左归丸可升高PI3K及AKT的磷酸化水平,上调下游蛋白Bcl-2的表达水平、下调Bax和Caspase-3的表达水平,而抑制剂可显著削弱上述效应,证明左归丸可调控PI3K/AKT信号通路及下游Bcl-2/Bax、Caspase-3蛋白表达,发挥抗神经细胞凋亡作用。相关细胞学实验研究同样揭示了左归丸发挥神经细胞保护作用的机制。刘家峰等[29]对原代大鼠海马神经元和胶质细胞的混合细胞给予氧糖剥夺并加左归丸含药血清,发现含药血清组细胞存活率明显上升,部分细胞氧化应激标志物和炎症因子水平下降,p-PI3K、p-AKT、Bcl-2/Bax蛋白表达明显上调,Caspase-3则明显下调,抑制剂可显著减弱上述改变,表明左归丸可通过调控PI3K/AKT信号通路有效减弱氧糖剥夺引发的氧化应激和炎症反应。

2.1.3 多发性硬化多发性硬化是一种中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘自身免疫性疾病[30],樊永平等[31]通过实验性自身免疫性脑脊髓炎模型模拟多发性硬化动物模型及立体细胞模型,发现左归丸可促进神经功能康复的多靶点信号分子网络的调控模式,其中可通过上调PI3K/AKT等信号转导,抑制Bax凋亡信号分子,激活mTOR,调节髓鞘蛋白的转录和翻译,促进中枢神经系统中少突胶质细胞的生长存活[32],减轻多发性硬化动物模型的神经元损伤和炎性反应,促进机体恢复。

综上所述,左归丸对痴呆及认知功能障碍相关疾病、脑缺血再灌注损伤、多发性硬化的防治作用,主要通过直接或间接调控PI3K/AKT信号通路,增加PI3K、AKT的磷酸化水平,影响下游靶蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、GSK3β、mTOR的表达,发挥抑制神经元凋亡、促进神经干细胞或原代细胞生长发育、调控胶质细胞生长、调节炎症反应等保护作用,从而达到治疗认知功能损伤、缓解学习记忆能力低下、增强神经细胞对缺血再灌注的适应能力及炎症损伤的修复能力等,发挥神经保护作用。

2.2 生殖系统疾病“肾藏精,主生殖”,肾精可直接参与女性的生理活动,且对生殖器官及其功能起着重要的调节作用[33],提示左归丸可以通过补肾生精来防治生殖系统疾病。

2.2.1 早发性卵巢功能不全早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性在40岁之前由于遗传、免疫、环境等因素出现卵巢功能减退的临床综合征[34],左归丸对POI有防治作用,并表现出多成分、多基因、多靶点的特点。曾丽华等[35]在基于网络药理学探讨左归丸治疗早发性卵巢功能不全的机制研究中,发现了83个有效活性成分,通过功能富集分析及京都基因百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析发现,显著性较高的信号通路包含PI3K/AKT、Cancer等,而Cancer通路中又包含PI3K/AKT等信号通路,提示左归丸可能通过PI3K/AKT信号通路起到治疗作用。王雨琦等[36]通过基因表达综合(gene expression omnibus,GEO)数据库进行早发性卵巢功能不全和健康人群的microRNAs差异分析、中药系统药理学数据库及分析平台(traditional Chinese medicines systems pharmacology platform,TCMSP)、KEGG富集分析,获得左归丸化裁方的65个交集靶点,其中包含了PI3K/AKT等多条信号通路,并涉及细胞自噬、细胞凋亡、炎症反应等多个病理过程。该课题组采用动物模型对上述生物信息学分析结果进行验证和深入研究,发现左归丸化裁方组的卵巢组织中PI3K、AKT等表达升高,推测左归丸化裁方可能通过上调PI3K并激活AKT,与一氧化氮合成酶结合生成一氧化氮,使血管舒张、重塑和生成,同时激活的PI3K/AKT信号通路可诱导血管内皮生长因子转录增加,形成正反馈调控,加速血管新生过程,发挥治疗作用[36]。

左归丸对药物及辐射造成的卵巢功能早衰具有保护作用。刘小莉[37]、杨静[38]均采用顺铂诱导卵巢早衰模型,并行左归丸干预,发现左归丸可改善卵巢组织内部结构,促进细胞增殖与卵泡发育,增多次级卵泡数量,减少闭锁卵泡数量,发挥改善卵巢功能、延缓卵巢衰老的作用。左归丸主要是通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,降低颗粒细胞自噬水平,降低下游FoxO3a蛋白表达并促进Bcl-2蛋白表达,有效抑制颗粒细胞受损及凋亡。赵粉琴等[39]对γ射线辐射造成卵巢功能早衰的大鼠给予左归丸干预一段时间后,同样发现了卵母细胞和颗粒细胞增殖,颗粒细胞凋亡则被抑制,其药理作用主要通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路、升高Bcl-2/Bax比值实现。有学者采用环磷酰胺建立卵巢早衰大鼠模型,探讨左归丸治疗卵巢早衰的疗效及机制,在治疗前后测定性激素水平、血清炎症因子水平、超声参数及生长分化因子-9 (growth differentiation factor-9,GDF-9)/Smad2的表达水平,发现左归丸可改善卵巢结构及功能,上调 GDF-9/Smad2表达,而Smad2则可根据PI3K激活的状态调控细胞命运[40-41]。

2.2.2 多囊卵巢综合征多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是以卵巢呈多囊样改变、卵泡发育异常、胰岛素抵抗和高雄激素血症为主要临床特征的一种内分泌疾病,是女性不孕的主要原因[42]。左归丸治疗PCOS的临床效果良好,推测其药物成分可调节子宫-卵巢-垂体性腺轴功能[43]。李臻[44]、莫阳等[45]对多囊卵巢综合征大鼠行左归丸干预后发现,AKT蛋白表达增加,磷酸化ERK1(phosphorylated-ERK1,p-ERK1)蛋白表达下降,鉴于有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signalregulated kinase,MAPK/ERK)和PI3K/AKT两条通路可相互作用,在生理状态下各司其职,病理状态下MAPK/ERK通路的异常激活可抑制PI3K/AKT通路,推测左归丸治疗多囊卵巢综合征的机制可能是通过抑制MAPK/ERK通路的异常激活并上调PI3K/AKT通路中重要因子的表达,调节信号通路平衡,进而发挥治疗作用。

2.2.3 子宫内膜损伤左归丸可平衡激素水平,促进子宫内膜细胞增殖分化,增加子宫内膜厚度并对子宫内膜损伤有修复作用[46]。江春燕[47]研究发现,薄型子宫内膜增殖期PI3K及AKT mRNA表达较正常子宫内膜明显下降,推测PI3K/AKT信号通路可能参与子宫内膜组织的增殖与分化,并对子宫内膜损伤大鼠模型给予左归丸干预,发现受损子宫内膜有一定程度的修复,如受损子宫内膜增厚、腺体个数增加、子宫内膜纤维化程度减轻,同时发现PI3K、AKT蛋白表达升高,AKT磷酸化水平增强,提示上述改变可能与左归丸激活PI3K/AKT信号通路有关,活化的AKT可激活血管内皮生长因子,促进子宫内膜血管形成,同时活化的AKT可促进Bcl-2蛋白表达并抑制Bax蛋白表达,抑制子宫内膜细胞凋亡、促进细胞增殖,从而发挥子宫内膜损伤的修复作用。

综上所述,左归丸对卵巢结构及功能的保护作用具有多成分、多基因、多靶点的特点。左归丸及其化裁方可使卵巢组织中PI3K表达升高,AKT激活,增加一氧化氮合成酶活性,增加血管内皮生长因子转录,使血管舒张、重塑,加速血管新生。激活的PI3K/AKT信号通路调控其下游靶蛋白mTOR、Bcl-2、Bax、FoxO3a、Smad2的表达,促进卵母细胞和颗粒细胞生长增殖及发育,抑制细胞凋亡,调节炎症反应,发挥对卵巢的保护作用;左归丸可激活子宫内膜的PI3K/AKT信号通路,上调Bcl-2蛋白表达并抑制Bax蛋白表达,促进血管生成,抑制细胞凋亡,促进损伤子宫内膜的修复。

2.3 内分泌系统疾病中医称糖尿病为消渴,中医认为精、气、血虚衰不仅是万病之源,也是导致胰腺分泌排放等功能失调的根本因素。消渴常见的证型有肝肾不足、肝肾亏虚等。肾藏精纳气、主津液代谢[48],故提示治疗糖尿病可从补肾益精、温壮肾阳入手。

左归丸可调节糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、脂质代谢,起到预防糖尿病及相关代谢性疾病的作用。赵灿[49]基于网络药理学构建左归丸干预2型糖尿病活性物质——潜在靶点网络并通过KEGG通路富集分析筛选,发现左归丸及其拆方后补阴、补阳药物配伍均主要集中在PI3K/AKT等信号通路。该课题组采用MKR 2型糖尿病小鼠做进一步研究,行左归丸及拆方后补阴、补阳药物干预,发现实验动物血糖下降,PI3K、AKT蛋白表达上升,且左归丸效果优于拆方后补阴、补阳药物,证实了左归丸可通过上调PI3K、AKT蛋白表达并抑制下游FoxO1表达,降低糖异生并增加胰岛素合成来干预2型糖尿病。郭亚菲等[50]采用血清化学实验联合网络药理学探究左归丸治疗糖尿病的机制,共筛选出左归丸中的表马钱苷酸、马钱苷酸、莫诺苷等9种活性成分,提示其可调控PI3K/AKT信号通路促进葡萄糖摄取和糖原合成,发挥治疗糖尿病的作用。许凯霞等[51]以ICR小鼠早期胚胎建立高葡萄糖模型并行左归丸含药血清体外培养,通过iTRAQ方法筛选差异蛋白并分析发现包含了PI3K/AKT信号通路在内的34个差异蛋白通路,发现左归丸可回调高浓度葡萄糖导致的PI3K/AKT下调,其具体机制可能是被激活的AKT直接抑制FoxO1的活性后减少糖异生,而磷酸化GSK3可促进糖原合成,降低葡萄糖水平,起到预防糖尿病及相关疾病的作用[52-53]。上述研究发现,左归丸激活PI3K/AKT信号通路,下调下游靶蛋白FoxO1表达抑制糖异生,磷酸化GSK3促进糖原合成,降低体内葡萄糖水平,发挥对糖尿病的防治作用。

2.4 骨科疾病骨质疏松症的主要特征是骨量减少和骨组织微结构退化[54],属于中医学“骨痹”“骨痿”等范畴,阴阳失衡、肾精亏虚是发病的关键机制[55]。肾藏精,精生髓,髓生骨,肾精足则髓足,髓藏于骨内,髓足则骨强,精气充足,骨髓得以充盈,为骨骼的生长、发育提供所需的营养,骨骼才能强健有力,因此治疗骨质疏松症可从补肾生髓入手[56]。

左归丸填精益髓,对防治肾精不足所致的骨质疏松症有效。赵军等[57]研究证实,左归丸整方可诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞等。基于中医学“补肾壮骨”治法的理论基础,黄胜男等[58]及范文斌等[59]运用网络药理学构建“活性成分-靶标-疾病”相互作用网络分析具体机制,发现左归丸可能通过包含PI3K/AKT通路在内的多靶点调控骨代谢平衡,并推测其激活AKT后抑制下游靶蛋白mTOR,诱导破骨细胞凋亡并抑制骨的吸收,促进成骨细胞增殖并抑制其分化,发挥对骨质疏松的治疗作用。赵旭等[60]建立去卵巢所致骨质疏松症大鼠模型,对左归丸防治绝经后骨质疏松症的分子机制进行探索,利用生物信息学分析方法观察骨髓间充质干细胞基因表达谱变化,发现左归丸通过PI3K/AKT信号通路对骨髓微环境发挥调节炎症反应和免疫功能的作用,是防治该病的潜在靶标。Yin等[61]研究左归丸对地塞米松诱导的斑马鱼幼体骨质疏松症的保护作用,发现左归丸可提高骨矿物质含量、增强骨生物力学、促进骨形成并抑制骨吸收,证明了左归丸可能通过逆转骨形成/骨吸收的不平衡和激活TGF-β/Smad信号来预防骨质疏松,而PI3K/AKT信号通路可通过AKT激酶依赖和独立机制拮抗TGF-β/Smad信号通路,发挥预防骨质疏松的作用[41]。

综上,左归丸通过激活PI3K/AKT信号通路,抑制下游靶蛋白mTOR,调控TGF-β/Smad,促进成骨细胞增殖,诱导破骨细胞凋亡,调节骨形成/骨吸收过程,调节炎症和免疫反应,发挥对骨质疏松的防治作用。

3 小结与展望

左归丸主要是运用中医“肾的精气血虚衰为万病之源”“肾主精生髓,通于脑”“肾藏精,主生殖”“肾精生髓,髓生骨”等理论将其与现代医学的神经系统、生殖系统、内分泌系统、骨科疾病等联系起来,通过滋阴益髓、温壮肾阳、充补精血,发挥对疾病的防治作用。现阶段,诸多学者对左归丸进行多途径、多靶点、多系统的深入研究,从分子水平揭示其药理作用及对疾病的防治机制。在左归丸基于PI3K/AKT信号通路防治相关疾病的分子机制研究中,多以动物及细胞模型作为主要研究对象,借助生物信息学及生命科学诸多技术,重点聚焦于PI3K/AKT信号通路下游Bcl-2、Bax、Caspase-3、GSK3β、mTOR、FoxO等靶蛋白,发现左归丸主要发挥调节细胞周期,促进细胞代谢、生长及增殖,抑制细胞凋亡,调节氧化应激、炎症反应及能量代谢,调控肿瘤细胞发生等生物学功能。以上基于信号通路及下游靶蛋白的深入系统研究,有利于对关于左归丸临床试验的相关研究进行指导,并充分挖掘其临床价值。

目前,关于左归丸的基础研究方面,缺乏其对PI3K/AKT信号通路上游靶点的调控作用,及其对信号通路关键蛋白AKT l、AKT 2和AKT 3三个不同亚型的精细化调控作用的相关研究,未来关于上述问题的深入研究,将有助于进一步精准揭示左归丸对相关疾病防治的药理作用及分子机制,以挖掘其更多的临床使用价值。