NETosis 与糖尿病足溃疡相关性研究进展

何於成 李开燕 周丁鹏 曾昭洋

糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最为严重的并发症之一，难愈、复发率高，同时有极高的致死和致残率。中性粒细胞（PMN）是抵御病原体入侵人体的第一道防线，其释放的中性粒细胞外诱捕网（NETs）具有捕获和消灭病原体的作用。NETs 的产生和释放称为NETosis，被认为是PMN 的一种独特类型的细胞死亡，参与了DFU 难愈合的发病机制[1，2]。研究表明，DFU 中过多或持续存在NETosis 会延迟创面愈合[3]。本研究通过NETosis 对DFU 愈合障碍的发病机制及作为潜在治疗靶点进行归纳总结，旨在为实验研究及临床治疗提供更充足的客观依据。

1 NETosis 的特征

NETs 的直径为15～17nm，来源于伴有组蛋白的核组分，并与杀微生物的球状蛋白复合，例如弹性蛋白酶、组织蛋白酶G 和髓过氧化物酶（MPO）[4，5]。NETs在细胞外空间中释放，其染色质网捕获微生物，限制它们的扩散并浓缩PMN 因子，从而增强杀微生物效果[6]，该过程被称为NETosis，是PMN 的一种独特类型的细胞死亡[7]。NETosis 主要分为以下两种形式[8]：①烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶依赖性途径是促炎物质激活NADPH 氧化酶而产生活性氧（ROS），其在NETs 的形成中起重要作用。由于激活NADPH 氧化酶是这个过程的关键步骤，因此被称为依赖NADPH 的NETosis。②NADPH 非依赖性途径是钙离子载体离子霉素、A23187、pH 升高等都可以诱导，其不依赖NADPH的NETosis。影响糖尿病足创面愈合的主要是依赖NADPH 的NETosis[9]。

NETosis 的途径之一是由NADPH 氧化酶产生ROS。ROS 促进PMN 释放中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和MPO，使NE 从嗜天青颗粒移位到胞浆中，并由此进入细胞核；在此NE 开始降解组蛋白，解开染色质并释放DNA。ROS 还激活蛋白-精氨酸脱亚胺酶4（PAD4），将组蛋白上的精氨酸转化为瓜氨酸，进一步支持染色质解浓缩和DNA 扩增，导致核膜破坏,染色质被释放到胞质溶浆中被各种颗粒和胞质蛋白修饰[10]。NETs 最终释放到细胞外空间中的确切机制尚未被描述，但已经提出了质膜的主动和程序化分解（与由于DNA 扩增导致的被动膜破裂相反）[11]。NADPH 合成对于维持ROS 爆发是必不可少的。在PMN 中，NADPH 由戊糖磷酸途径的氧化分支（oxPPP）中的葡萄糖6-磷酸产生。事实上，葡萄糖6-磷酸脱氢酶（oxPPP 的第一种酶）缺陷患者表现出低水平的NADPH 和ROS，并且对细菌感染的易感性高得多[12]。

1.1 NETosis 与巨噬细胞巨噬细胞吞噬NETs，然后在溶酶体中降解。虽然这种降解本身不会诱导巨噬细胞产生促炎性细胞因子，但在脂多糖（LPS）存在下，促进巨噬细胞释放白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）[13]。当NETs 从吞噬体移位到胞质溶胶时，DNA 可以被DNA 传感器环GMP-AMP 合酶（cGAS）识别，其诱导体外和体内I 型干扰素的产生。cGAS/STING 途径的刺激依赖于DNA 相关的NE，并且NE 活性的抑制可减少一半干扰素的产生[14]。也有研究表明[15]，巨噬细胞在NETs 降解后表现出表型依赖性反应，作用数小时后，M2 巨噬细胞诱导促炎反应，而M1 巨噬细胞经历细胞死亡和核去凝。M1 巨噬细胞的核去凝聚作用以PAD4 依赖性方式发生，并导致细胞外DNA 的局部释放。此后，M1 巨噬细胞以半胱天冬酶激活的DNA 酶降解自身的DNA，导致细胞外DNA 在24h 内清除。

1.2 NETosis 与血小板血小板是主要的外源性PMN 调节因子。病原体或细菌激活的血小板可以有效地诱导NETs 形成，进一步促进炎症。血小板诱导NETs 的形成需要P-选择素（其在活化时在血小板表面上调）和P-选择素糖蛋白配体I（PSGL-1）（其在PMN 上表达）之间的相互作用[16]。血小板上P-选择素和GPIbα/Mac-1 之间的相互作用也可调节NETosis[17]。除P-选择素外，血小板还同时释放可溶性因子，以聚集和维持NETs 的形成[17]。事实上，过度的血小板活化决定了白细胞的过度聚集和炎症的诱导，并促进NETs 的释放。在感染的初始阶段，NETs 对于诱捕细菌和防止细菌在血液中传播至关重要[18]。但NETs 也促进血小板聚集、凝血酶活化和纤维蛋白凝块形成，进而导致弥散性血管内凝血（DIC），最终损害组织氧合并导致患者死亡[19]。

在DFU 愈合中炎症阶段极为关键。过量的ROS 使机体内氧化还原失衡[20]，严重影响创面周围神经血供与作用机制[21]，还会使促炎性因子进一步表达[22]。同时巨噬细胞M1 也会释放大量促炎性因子，导致过度的炎症反应使创面停滞在炎性阶段，从而迁延不愈[23]。

2 高糖状态对NETosis 的影响

高浓度的葡萄糖促进ROS 介导的NF-κB活化，其进一步增加晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的表达[24]。进一步证实，高血糖状态及相关代谢损伤可使PMN 引发NETs 表达，同时减少吞噬作用。在高血糖条件下培养的PMN，它的代谢紊乱可使PMN 中超氧化物增加和促炎性病症的激活，并且垂死的PMN 可释放大囊泡，进而使邻近的PMN 致力于NETosis。与吞噬作用相比，高血糖症还可能诱导促进NETosis 的下游[25]。总之高血糖可直接或间接通过AGE-RAGE 二级机制诱导氧化应激，通过激活NADPH 氧化酶导致自噬和自发性NETosis，同时减少吞噬作用[25]。

3 NETosis 与DFU

最近，许多研究表明过量NETosis 已被证明与DFU 愈合密切相关。伤口感染也可使PMN 活化和NETs 释放[26，27]。有研究发现[28]，当NETs 出现于皮肤伤口时，在野生型（WT）小鼠皮肤伤口中产生大量NETs，但在Padi 4-/-（小鼠的PAD4 由PADi4 基因编码）小鼠中未观察到。并且与WT 小鼠相比，Padi 4-/-小鼠的伤口愈合加速，并且不受糖尿病的影响。脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）可破坏NETs，加速糖尿病和血糖正常WT 小鼠的伤口愈合。因此，NETs 严重影响伤口愈合，特别是在糖尿病中，PMN 对NETosis 更敏感。抑制NETosis 或切割NETs 可能会改善伤口愈合，并减少糖尿病中NETs驱动的慢性炎症。使用蛋白组学，NETs 被发现在非愈合人类DFU 中升高。此外，由于DFU 与全身炎症相关，因此在DFU 患者的血流中评估NETosis生物标志物与不具有DFU 的匹配糖尿病患者相比。NETs 成分包括弹性蛋白酶、组蛋白、PMN 明胶酶相关的脂质运载蛋白和蛋白酶3，被发现在DFU患者的血液中升高[3]。同时，与正常血糖对照小鼠（LepRm+/db）相比，缺乏瘦素受体（LepRdb/db）的糖尿病小鼠中伤口愈合显著延迟，伴随着高NETs 水平。此外，dsDNA、PAD4 和瓜氨酸化组蛋白H3 在体外佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）诱导的NETosis 模型中均显著升高[29]。

近年NETosis 与DFU 之间的联系已成为众多学者研究热点。Yang 等[30]在糖尿病大鼠中发现NOD 样受体蛋 白3（NLRP3）、半胱天冬 酶1（Caspase-1）和消皮素D（GSDMD）的基因敲除阻止NETs 释放并阻碍伤口愈合。Lee 等[31]用PMA 刺激PMN 以诱导NETosis，然后与DNaseI 孵育。他们将PMN 与巨噬细胞共培养，发现NETs 确实激活了NLRP3 炎性小体并增加了IL-1β，而在用DNaseI 处理的样本中没有发现这一点。最后，当给糖尿病大鼠注射DNaseI 时，发现NETs 降解改善了伤口愈合。Lee 等[32]发现促性腺激素释放激素激动剂促进NETosis 和增加NETosis 诱导延迟伤口愈合。Stavrou 等[33]报道，凝血因子Ⅻ（F Ⅻ）在活化后由PMN 分泌，其上调αMb2 整联蛋白并增加αMb2 的表达。细胞内钙离子浓度升高，导致组蛋白瓜氨酸化和NETs 形成，延迟伤口愈合。血管生成在皮肤创伤愈合中起重要作用，Yang 等[2]最新发现从糖尿病患者外周血中分离的PMN 加剧NETosis 反应。NET 成分在糖尿病患者未愈合创面中富集。糖尿病伤口环境促使PMN 形成NETs，NETs 通过内皮细胞中的Toll 样受体9（TLR-9）诱导p21 激活激酶（PAK2）活化。然后PAK2 磷酸化细胞内蛋白NF2/Merlin（神经纤维蛋白2 基因/编码抑癌蛋白）来抑制Hippo/Yes 相关蛋白（Hippo-YAP）途径。Yes 相关蛋白（YAP）与SMAD2 结合，从细胞质易位到细胞核中以促进内皮-间充质转化（EndMT），最终阻碍血管生成并延迟糖尿病伤口愈合。

4 NETosis 作为DFU 潜在治疗靶点

随着DFU 愈合延迟与NETosis 之间相关性研究的不断深入，NETosis 成为了治疗DFU 的新型靶点，通过抑制或减少NETosis 引起的慢性炎性反应从而促进DFU 愈合。

Das 等[34]已经发现PKCβⅡ抑制剂Ruboxistaurin 可以抑制GSDMD，有效消除NETosis，逆转内皮祖细胞功能障碍并防止NETs 过度形成。Liu等[35]研究了富含亮氨酸的α2-糖蛋白1（LRG1）在正常伤口和糖尿病伤口愈合中的作用。在机制上，LRGl 通过TGF-βⅠ型受体激酶ALK5 以Akt依赖性方式介导NETosis。研究表明，来自骨髓细胞的LRG1 是正常伤口愈合所需的，但在糖尿病中过量的LRG1 表达是致病性的，并易导致慢性伤口形成。针对LRG1 抑制过度NETosis 以加速DFU 愈合是一个有吸引力的策略。Yang 等[29]首次发现用硫化氢（H2S）处理可以抑制NETosis 和NETs 释放，从而改善糖尿病伤口愈合，其机制与抑制ROS 诱导的MAPK、ERK1/2 和p38 活化有关。Huang 等[36]鉴定了乳脂球表皮生长因子Ⅷ（MFG-E8）介导的糖尿病伤口损伤的保护机制包括：①抑制活化的NLRP 3炎性体靶向IL-1β/IL-18 合成；②减弱由炎性细胞因子IL-1β/IL-18 诱导的NETs 从PMN 的释放；③可能通过整合素β3 和限制性P2 X7 受体来控制NETs引发的NLRP3 炎性体活化；④伤口中血管生成的增强。MFG-E8 诱导伤口炎症的消退，减少NETS积累，改善血管生成，并加速伤口闭合，支持外源性MFG-E8 施用对糖尿病伤口治疗具有可能的治疗潜力。Basyreva 等[37]使用适量的维生素D3/ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFA）的摄入抑制了健康受试者和2 型糖尿病患者的全血样品中PMA，从而减少NETs 形成和细胞死亡。Hallberg 等[38]在研究中表明硫氰酸盐（SCN-）和硒氰酸盐（SeCN-）的使用可能会导致NETs 释放和HOCl 产生的减少，以最大限度地减少宿主细胞的损伤，同时可杀死细菌。这些浓度的氮氧化物是无毒的，并且在体内容易实现。它们发挥抗炎和自由基清除作用的能力可能是有利的，特别是在慢性炎性疾病中，其在PMN 和其他免疫细胞的浸润以及许多破坏性途径中激活。Kaur 等[39]报道了含TDFA（一种由苏氨酸、天冬氨酸和鸟氨酸组成的三肽，是第二代不可逆抑制剂，它修饰了PAD4 酶的活性位点残基）的海藻酸盐-GelMa 支架的开发，用于治疗糖尿病伤口。由于TDFA 的存在，所开发的支架能够更好地使细胞粘附、铺展和增殖。体外PMN-支架相互作用结果表明NETosis 减少。Menegazzo 等[40]发现二甲双胍治疗降低了NETs 组分的浓度，其对PKCNADPH 氧化酶途径的抑制作用相关。二甲双胍抑制NETosis 是一种新的药理学作用，其可以潜在地改善糖尿病中的免疫炎症。同时另有学者研究发现[41]当患者接受大环内酯类克拉霉素治疗时，通过上调NETs 上的LL-37 恢复抗菌能力。同时，由于真皮成纤维细胞活化和分化，观察到伤口愈合改善。这些发现表明NETs 在伤口愈合中的直接积极生理作用，超过了它们的防御性抗菌作用。

5 小结与展望

由PMN 释放的NETs 可以捕获或杀死多种病原体。根据当前研究，自噬驱动的NETosis，既可以是有益的，也可以是有害的。在许多疾病中，NETs的过量产生可导致组织损伤并加速疾病恶化，自发或诱导产生过量的NETosis 揭示了NETs 的负面作用，因此它们成为了慢性炎症的效应物。在DFU 中NETosis 的过度表达会损害伤口愈合。因此有效调节失控的NETosis 为DFU 的治疗展现了新的前景和曙光，在未来可能很有希望研究出更加有效的治疗方案。