甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂制备及其抗逆性能评价

胡素楠，战映妤，陈泳汀，王淑涵，郑桂玲，张保华

(青岛农业大学新农药创制研究所，青岛 266109)

农药在防治病虫草害、保障农作物稳产高产等方面发挥着不可忽视的作用，已经成为一种重要的农业生产资料[1]。但化学农药由于长期使用，对土壤、空气以及水源等环境生态造成不良影响，其在农产品中的残留也威胁到了食品安全[2]。生物农药具有选择性强，对人畜安全高效，对生态环境影响较小等优点，已经成为病虫害绿色防控和农业可持续发展的重要保障之一[3]。

甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exiguan ucleopolyhedrovirus，SeNPV)来源于致病的甜菜夜蛾幼虫，对甜菜夜蛾及相同科属的大部分害虫具有专一活性和高致病力，属于环境友好的生物杀虫剂[4]。甜菜夜蛾核型多角体病毒能够有效控制甜菜夜蛾种群的数量增长，尤其对抗性甜菜夜蛾有良好的防治效果，具有重要的经济、生态和环保价值，应用前景广阔。核型多角体病毒主要由多角体蛋白和其包裹的病毒粒子构成，在高温和紫外照射条件下易变性失活，影响其杀虫性能[5]。

海藻酸钠(sodium alginate)是一种来源广泛、成本低廉的天然多糖大分子化合物，可与钙离子等金属阳离子发生固化形成凝胶，具有良好的生物相容性，在环境中易被生物降解，同时对人畜无毒，因此常被用作载药材料[6-7]，尤其是作为蛋白质类生物活性物质、活体细胞、真菌或细菌等的载体或包埋材料[8-9]。

基于海藻酸钠的良好生物降解性和生物相容性，本研究以海藻酸钠为包埋材料，通过优化载体浓度、进样速率等工艺条件，采用喷雾法制备了甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂，采用扫描电镜等手段对其进行了表征，并进一步考察病毒颗粒剂的热稳定性、抗紫外性能和杀虫活性，从而为SeNPV 病毒制剂的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器与设备

HH—1 型数显恒温水浴锅(江苏金坛荣华仪器制造有限公司)，78 HW—1 数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)，HC—3018 高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，FA1104 B 电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，BT—9300 ST 激光粒度分布仪(丹东百特仪器有限公司)，JEOL7500 F型扫描电子显微镜(日本电子公司)，FD—1A—50 冷冻干燥机(上海比郎仪器制造有限公司)。

1.1.2 药品与试剂

甜菜夜蛾核型多角体病毒(青岛农业大学植物医学学院)，海藻酸钠(AR，天津市博迪化工有限公司)，氯化钙(AR，天津市巴斯夫化工有限公司)。

1.1.3 试验虫源

甜菜夜蛾3 龄幼虫(青岛农业大学植物医学院实验室饲养)。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒海藻酸钠颗粒剂制备与表征

病毒海藻酸钠颗粒剂的制备 参考颜光耀等[10]的方法，先配制一定质量浓度的海藻酸钠溶液，将1 mL SeNPV(浓度为1.5×106PIB/mL)缓缓滴加到海藻酸钠溶液中，避光磁力搅拌1 h。然后将均匀混合的含病毒的海藻酸钠溶液使用二流体喷嘴进行雾化(喷嘴与液面相距20 cm)，按照一定的进样速率将雾化液喷入0.1 mol/L 的氯化钙溶液中进行凝聚。喷雾结束后，取部分病毒颗粒剂悬浮液，用激光粒度分布仪测量病毒颗粒剂的粒径大小。并将剩余的颗粒剂悬浮液进行抽滤，冷冻干燥，得到病毒海藻酸钠颗粒剂固体试样，将试样置于4 ℃冰箱中保存待用。

制备工艺单因素试验 以海藻酸钠质量浓度和进样速率为制备条件，进行制备工艺优化，海藻酸钠浓度设为0.5%、1.0%、1.5%，进样速率分别为11、13、15 mL/min，其他条件保持一致，按照上述方法步骤制备病毒颗粒剂。

1.2.2 病毒海藻酸钠颗粒剂的形貌表征

取干燥至恒重的颗粒剂试样少许，用扫描电子显微镜(SEM)观察颗粒剂形貌。

1.2.3 病毒海藻酸钠颗粒剂的生物活性测定

采用饲料混毒法测定病毒颗粒剂对甜菜夜蛾幼虫的生物活性。分别取病毒含量一致的病毒悬浮液和病毒颗粒剂悬浮液，取0.2 mL 用一次性注射器均匀滴加到饲料上，晾干，使表面没有明显的水渍。挑取大小均匀的3 龄甜菜夜蛾幼虫15 头，轻轻地放在装有混毒饲料的培养皿中，置于培养箱(温度为25 ℃，湿度为65%)中观察培养，每24 h 观察记录幼虫的病死数量，并记录病虫死虫的形态特征，观察7 d 或直至幼虫全部死亡。每个处理重复3 次，计算平均死亡率。

1.2.4 病毒海藻酸颗粒剂的抗紫外线性能测定

称取0.02 g 病毒海藻酸钠颗粒剂，用蒸馏水配制成2 mL 的溶液，3 次重复。分别于紫外分析仪(30 W，波长范围在200～300 nm，255 nm 处最强) 中照射1、2 h。处理完成后，放置于4 ℃冰箱保存备用。配制2 mL 与上述处理含有相同病毒量的SeNPV 溶液作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照，在紫外线条件下处理相同时间。将紫外处理过的蒸馏水、SeNPV、病毒颗粒剂溶液采用饲料混毒法测定对甜菜夜蛾幼虫的生物活性，记录7 d 的死亡率。

1.2.5 病毒海藻酸钠颗粒剂的耐热性能测定

将SeNPV 和病毒颗粒剂分别用蒸馏水配制成病毒含量相同的悬浮液，取2 mL 分装于10 mL 离心管中，水浴加热并测量温度。加热处理分成2 组：温度设置为25、35、45 ℃，处理时间为6 h，处理后的病毒溶液冷却至室温后置于4 ℃冰箱冷藏保存。采用饲料混毒法测定处理的病毒和病毒颗粒剂对甜菜夜蛾幼虫的生物活性，记录7 d 的死亡率。

2 结果与讨论

2.1 病毒海藻酸钠颗粒剂制备

2.1.1 海藻酸钠浓度对颗粒剂性能及对甜菜夜蛾幼虫死亡率的影响

已有研究表明，载体用量会影响颗粒剂的形态、产率和粒径等性能[11-12]，表1 是选用不同用量的海藻酸钠所制备的病毒颗粒剂的产率和粒径。其中当海藻酸钠用量为1%时，颗粒剂产率最高，达到79.43%，海藻酸钠用量为0.5%时，所得颗粒剂的中位径(D50)最小，但海藻酸钠含量为1%、1.5%的中位径(D50)差异不显著。表明海藻酸钠含量较低时，形成的颗粒剂不能完整包埋病毒，导致颗粒剂粒径偏小和颗粒剂的产率偏低，但海藻酸钠含量过高时，黏度增大，雾化效果差，也影响了颗粒剂的产率。

表1 不同海藻酸钠用量制备的颗粒剂的产率及中位径

由图1 不同病毒颗粒剂对甜菜夜蛾幼虫的致死曲线趋势可以看出，所制备的海藻酸钠病毒颗粒剂的感染力及致病力与SeNPV 病毒差异不显著，说明包埋病毒不会影响SeNPV 病毒的感染力及致病力。

图1 海藻酸钠浓度对病毒颗粒剂对甜菜夜蛾3 龄幼虫致死能力的影响

图2为不同用量海藻酸钠制备的病毒颗粒剂的扫描电镜图和粒径分布，由图2 中A～C 图可以看出，所制备的病毒颗粒剂均呈不规则形状，其中海藻酸钠用量为1%时，外观相对饱满，表面光滑，形状较为规则。图2 D 显示的是不同海藻酸钠用量对病毒颗粒剂的粒度的影响，可以看出，0.5%的海藻酸钠用量制备的颗粒剂粒度分布不如其他海藻酸钠用量制备的颗粒剂集中，结合颗粒剂产率，确定1%的海藻酸钠作为病毒颗粒剂制备的载体用量。

图2 海藻酸钠浓度对病毒颗粒剂的形貌和粒径的影响

2.1.2 进样速率对颗粒剂性能及对甜菜夜蛾幼虫死亡率的影响

表2为不同进样速率制备的病毒颗粒剂的产率及中位径(D50)的大小，随着进样速率的增加，D50略微增大，但进样速率为13 mL/min 时，颗粒剂的产率最高，达到77.24%。

表2 不同进样速率制备的颗粒剂的产率和中位径

图3为不同进样速率制备的病毒颗粒剂对甜菜夜蛾3 龄幼虫致死率的影响，由图3 可知，海藻酸钠病毒颗粒剂对甜菜夜蛾幼虫的致死率均随着时间的延长而提高，且与未加工成颗粒剂的病毒致死率的趋势接近一致，说明进料速率没有降低颗粒剂中病毒的杀虫活性。

图3 不同进料速率制备的病毒颗粒剂对甜菜夜蛾3 龄幼虫致死率的影响

图4为不同进料速率制备的病毒颗粒剂的外观形貌和粒径分布。由图4A～4 C 可以看出，不同进料速率对病毒颗粒剂的形貌影响不大，所制备的颗粒剂均呈现不规则多面形状，其中进料速率为13 mL/min时，形貌较为规则。图4 D 病毒颗粒剂的粒度分布显示进料速率对颗粒剂的粒径和分布影响不显著，粒径分布较集中，D50在130 μm 左右，综合病毒颗粒剂的产率，确定进料速率为13 mL/min。

图4 进料速率对病毒颗粒剂的形貌和粒径的影响

基于以上对病毒颗粒剂制备中海藻酸钠用量、进料速率等的优化筛选，确定海藻酸钠用量为1%，进样速率为13 mL/min。在此基础上制备病毒颗粒剂(病毒含量1.0×106PBI/g)，并以甜菜夜蛾3 龄幼虫为对象，测定病毒颗粒剂的杀虫活性，具体结果见图5。由图5 可以看出，海藻酸钠病毒颗粒剂的杀虫活性随时间的趋势图与未加工的病毒的杀虫活性接近，说明病毒经包埋后没有降低甜菜夜蛾核型多角体病毒的杀虫活性。

图5 病毒颗粒剂化对甜菜夜蛾3 龄幼虫致死率的影响

2.2 病毒颗粒剂的抗紫外辐射和耐热性能

昆虫病毒对环境适应性较差，尤其对紫外线和高热比较敏感，容易失活[13]。因此，本文考察了病毒颗粒剂化对其抗紫外和耐热性能的影响，具体结果如图6。从图6 A 中可以看出，紫外处理1、2 h后的SeNPV 的死亡率分别为40.25%、33.33%；病毒颗粒剂的死亡率分别为59.83%、46.67%，颗粒剂化的SeNPV 对甜菜夜蛾幼虫的致死率均高于未包埋的SeNPV，说明病毒颗粒剂化后对紫外线有一定的抵抗能力，可以降低紫外线对SeNPV 的杀灭作用。图6 B 是不同处理温度对病毒和病毒颗粒剂杀虫活力的影响。由图中可以分析，35 ℃处理下甜菜夜蛾幼虫累积死亡率明显高于25、45 ℃的处理，但在一定温度范围内，温度越高，能增强病毒的活性。同时可以看到，相对于未包埋的昆虫病毒，病毒包埋后可以减轻温度对病毒活力的影响，对甜菜夜蛾幼虫保持较高的致死率。

图6 病毒颗粒剂化对其抗紫外辐射(A)和耐热性能(B)的影响

3 结论

甜菜夜蛾核型多角体病毒是一类具有环境友好、毒力专一性强的昆虫病毒类生物农药，本研究以海藻酸钠为包埋材料，结合对海藻酸钠浓度、进料量等工艺条件的优化，利用喷雾法制备了病毒颗粒剂，所得的病毒颗粒剂形状不规则，产品产率达到79.4%，病毒含量1.0×106PBI/g，D50在130µm 左右，且病毒颗粒剂具有良好的热稳定性和抗紫外性能。研究结果为甜菜夜蛾核型多角体病毒制剂的研究和应用提供了思路。