四氢嘧啶的生物保护作用及其在食品领域的应用

宋琪 孙立瑞 尹一 夏春谷 辛嘉英

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.036

引文格式：宋琪，孙立瑞，尹一，等.四氢嘧啶的生物保护作用及其在食品领域的应用[J].中国调味品，2024，49（5）：213-220.

SONG Q， SUN L R， YIN Y， et al. Bioprotection effect of ectoine and its application in food field[J].China Condiment，2024，49（5）：213-220.

摘要：四氢嘧啶是一种保护性相容性溶质，可以保护生物大分子和细胞免受高温、极端pH、干燥、冷冻、辐射等不利环境条件的影响。因此，四氢嘧啶可用于新型食品添加剂的开发，广泛应用于食品生产加工过程中的酶保护、发酵菌体保护、食品保质期延长以及功能性食品开发等方面。基于近年来国内外的研究现状，综述了四氢嘧啶的生物合成-降解途径、生物保护作用机制及其应用，重点介绍了其在食品领域的应用，以期为四氢嘧啶类相容性溶质在食品领域的研究、开发和应用提供参考。

关键词：四氢嘧啶；羟基四氢嘧啶；生物保护；食品添加剂

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）05-0213-08

Bioprotection Effect of Ectoine and Its Application in Food Field

SONG Qi1， SUN Li-rui1， YIN Yi1， XIA Chun-gu2， XIN Jia-ying1，2*

（1.Key Laboratory of Food Science and Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150028，

China; 2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation， Lanzhou Institute of

Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730013， China）

Abstract： Ectoine is a protective compatible solute， and can protect biomacromolecules and cells from adverse environmental conditions such as high temperature， extreme pH， drying， freezing， radiation and so on. Therefore， ectoine can be used in the development of new food additives， and can be widely used in enzyme protection， fermentation bacteria protection， food shelf life extension and functional food development and other aspects during food production and processing. Based on the research status at home and abroad in recent years， the biosynthesis-degradation pathway， bioprotection mechanism and application of ectoine have been discussed， with emphasis on its application in food field， in order to provide references for the research， development and application of ectoine compatible solutes in food field.

Key words： ectoine; hydroxyectoine; bioprotection; food additive

收稿日期：2023-11-06

基金項目：中央支持地方高校改革发展资金人才培养支持计划项目（高水平人才）（304017）

作者简介：宋琪（1999—），女，硕士研究生，研究方向：生物催化。

*通信作者：辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向：生物催化。

相容性溶质（compatible solutes）是参与细胞内渗透压补偿体系而不影响细胞正常生命活动的溶质，这些溶质可以在细胞中积累到高浓度，调节细胞的渗透压，进而防止细胞脱水[1-2]。随后，四氢嘧啶（ectoine，1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸）及其衍生物羟基四氢嘧啶（hydroxyectoine，1，4，5，6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸）作为渗透相容性溶质被发现[3]。四氢嘧啶是耐盐和嗜盐微生物的次级代谢产物，是一种分子量为42.16 Da的环状氨基酸衍生物，分子式为C6H10N2O2，其结构图见图1。四氢嘧啶易溶解，多数不带电荷或以两性离子状态聚集在细胞中，调节细胞的渗透压平衡[4]。

四氢嘧啶及其衍生物是一种高效的生物大分子和细胞保护剂，可以保护蛋白、核酸、生物膜等生物大分子和整个细胞免受高盐、高温、冷冻等不利环境条件的影响，且对生物大分子的结构和细胞的正常生命活动均无不良影响[5-7]，其生物保护作用一直受到各国研究者的广泛关注。随后，四氢嘧啶作为发酵食品中的天然成分被检测到[8]，因而开始了其在食品领域的研究。在食品工业中，四氢嘧啶主要应用于酶保护、菌体细胞保护、食品保质期延长和功能性食品开发等领域，其生物保护作用在食品领域具有广阔的前景，但相比于生物医药和生物工程等领域，其在食品领域的应用潜质一直被忽视[9]。另外，四氢嘧啶的生物保护机制不明确也是阻碍其应用研究的原因之一。因此，需要继续深入探索四氢嘧啶的保护机制以发挥其功效的最优化，进而开发其生物保护作用的新应用，拓宽四氢嘧啶在食品领域的应用范围。

1  四氢嘧啶的生物合成

1.1  四氢嘧啶的生物合成-降解途径

四氢嘧啶主要分布在耐盐和嗜盐微生物中，如变形菌门（Proteobacteria）中的盐单胞菌属（Halomonas）和色盐杆菌属（Chromohalobacter）等菌属；厚壁菌门（Firmicutes）中的芽孢杆菌属（Bacillus）、盐水球菌属（Salinicoccus）、

嗜盐海球菌属（Marinococcus）、甲烷丝菌属 （Methanothrix） 和甲烷杆菌属（Methanobacterium）等菌属[9]。四氢嘧啶是一种环状氨基酸衍生物，因其化学结构中存在手性碳原子，故化学方法难以合成。另外，用化学方法合成四氢嘧啶工业能耗高、环境污染风险大，故工业生产四氢嘧啶时主要选择生物合成的方法。

目前，四氢嘧啶的生物合成-降解途径已在基因水平和酶水平上有了较成熟的阐述[10]。四氢嘧啶的生物合成途径由Peters等[11]首次阐述。随后，Schwibbert等也完成了四氢嘧啶降解途径的完整解析。至此四氢嘧啶生物合成-降解途径被完整解析出来，其详细生物合成-降解途径见图2。四氢嘧啶生物合成-降解途径的解析为四氢嘧啶的工业大规模生产提供了理论基础，也为四氢嘧啶生物合成方法的研究与开发提供了理论依据。

羟基四氢嘧啶是四氢嘧啶最常见的衍生物，与四氢嘧啶具有相似的生物学功能，其在特定环境下的保护作用甚至优于四氢嘧啶，也是典型的保护性相容性溶质之一。羟基四氢嘧啶通常由四氢嘧啶在四氢嘧啶羟化酶（ectoine hydroxylase，EctD）的催化作用下直接转化得到，这一途径被认为是羟基四氢嘧啶的主要合成途径[12-13]。然而，后续研究发现当人为阻断EctD的活性时，仍有少量的羟基四氢嘧啶合成[14]。基于此，Ono等[15]发现四氢嘧啶前体物质NADA（N-乙酰-L-2，4-二氨基丁酸）可以在不涉及四氢嘧啶的情况下直接合成羟基四氢嘧啶，进一步完善了羟基四氢嘧啶的生物合成途径。

注：AsK为天冬氨酸激酶，AsD为L-天冬氨酸-半醛脱氢酶，EctA为2，4-二氨基丁酸乙酰基转移酶，EctB为2，4-二氨基丁酸转移酶，EctC为四氢嘧啶合成酶，EctD为四氢嘧啶羟化酶，DoeA为四氢嘧啶水解酶，DoeB为N-乙酰-L-2，4-二氨基丁酸脱乙酰酶，DoeC为天冬氨酸半醛脱氢酶，DoeD为L-2，4-二氨基丁酸转氨酶。

1.2  四氢嘧啶的生物合成方法

四氢嘧啶的生产主要采用“细菌挤奶”工艺，“细菌挤奶”法是指嗜盐菌在高渗透压的诱导下迅速合成四氢嘧啶，然后在低渗透压的冲击下释放细胞内的四氢嘧啶，四氢嘧啶的合成与释放在该过程中反复循环，从而生产四氢嘧啶。目前国内外应用于四氢嘧啶工业大规模生产的传统菌株主要集中于盐单胞菌属 （Halomonas） [16-18]、色盐杆菌属 （Chromohalobacter）[19]和海洋杆菌属（Marinobacter）[20-21]等。然而，应用传统高盐培养基生产四氢嘧啶存在发酵罐腐蚀和菌种老化等诸多不足，使四氢嘧啶的产量下降。针对传统方法的不足，目前多采用筛选高产野生菌株、诱变育种[22]和构建基因工程菌株（利用大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等菌株异源合成四氫嘧啶）[23-26]等方法优化四氢嘧啶的工业生产。

由于日益严格的环保要求，通过绿色方式处理工业生产中产生的废气成为重要的发展趋势。利用甲烷和二氧化碳（CO2）等工业废气作为碳源合成有价值的化学品的相关研究越来越受到关注[27-28]。王广交等[29-30]报道，甲烷氧化菌可以利用“生物挤奶”的工艺，以甲烷为唯一碳源在无盐条件下生产四氢嘧啶。与以传统碳水化合物为碳源的菌株相比，此方法无需高浓度盐的生产条件，不易对仪器造成腐蚀，具有分离提纯简单、经济价值高和环境友好等诸多优势。另外，以甲烷作为唯一碳源生物合成四氢嘧啶的生产方式是甲烷作为能源的一种高利润替代方案，也是一种比生产低附加值生物产品更可行的增值途径，具有更高的经济价值。

2  四氢嘧啶的生物保护作用机制

四氢嘧啶保护机制的研究为其实际应用提供了理论基础。深入探讨四氢嘧啶的保护机制有助于其合理使用，进而拓宽其在各领域的应用。目前，包括四氢嘧啶在内的相容性溶质的保护机制尚不完全明确，已经提出了水关系理论、水替换假说、疏渗作用和优先排阻模型等理论，其中“优先排组模型”理论是公认的相容性溶质稳定作用的通用机制，是四氢嘧啶保护作用的主要解释[31-32]。“优先排组模型”理论认为，由于四氢嘧啶与生物大分子（此处以蛋白质为例）的不利相互作用，四氢嘧啶将被排除在蛋白质直接水化层之外，同时减缓了水从蛋白质表面的扩散，促进蛋白质水合，从而稳定了蛋白质的水合层，进而稳定蛋白质的构象，使蛋白质保持天然状态，不发生变性[33-35]，其保护机制示意图见图3。

1985年，Arakawa等[36]首次通过优先排阻模型证明了蛋白质在渗透压下的稳定性。研究发现相容性溶质稳定了溶菌酶的结构，并且被排除在蛋白质（溶菌酶）结构域水化层之外。Arakawa和Timasheff的研究证实了相容性溶质对蛋白质的保护符合优先排阻模型，但他们的研究并不包括四氢嘧啶及其衍生物的保护机制。在此基础上，Yu等[37]用分子动力学方法证实了四氢嘧啶也遵循优先排阻模型。Eiberweiser等[32]报道，在各种生物保护机制中，“优先排除模型”最能描述四氢嘧啶的生物作用。Zaccai等[38]利用体内氘标记、小神经元散射、中子膜衍射、非弹性散射和中子液体衍射等方法对四氢嘧啶的生物保护机制进行了表征，为“优先排阻模型”理论提供了数据支持。

四氢嘧啶及其衍生物对细胞的保护作用归因于其对细胞膜的保护作用。各种极端条件如高温、渗透压和有毒化学物质等都可能损害细胞膜的功能，导致细胞脱水和变性。Herzoga等[39]报道，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶可以通过对细胞膜的影响来稳定细胞和细胞系统，使细胞免受不同应激因素的影响。四氢嘧啶周围形成有组织的水团，与膜表面的脂质分子存在不利相互作用，改善细胞表面的水合作用，增加分子间的间距，提高细胞膜中脂质头部基团的流动性，进而增加细胞膜的整体流动性，保护细胞免受不利环境条件的影响[40]，其保护机制示意图见图4。四氢嘧啶被排除在膜表面的水化层之外，对膜的分子动力学不会产生影响，不干扰细胞的正常生命活动[41]。

3  四氢嘧啶的生物保护作用

3.1  四氢嘧啶对生物大分子的保护

3.1.1  酶保护

四氢嘧啶及其衍生物增强了蛋白质稳定性所必需的分子内相互作用，降低了蛋白质对变性的敏感程度，从而增加了酶的稳定性。许多研究报道，四氢嘧啶可以作为高效的酶保护剂，使人们在各种酶生物技术中使用四氢嘧啶及其衍生物作为酶保护剂的兴趣越来越大。

羟基四氢嘧啶对pH和温度胁迫下的耐盐芽孢杆菌产生的木聚糖酶有明显的保护作用[42]。Gller等[43]报道，相容性溶质四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶对冻融、热处理和冻干过程中的乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸果糖激酶（PFK）都显示出显著的稳定能力。 Samantha等[44]总结在冷冻和冻干条件下，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶对LDH和PFK两种酶均有保护作用。

作为化学催化剂的替代品，脂肪酶被广泛用作生物柴油生产中的生物催化剂，Parwata等[45]在加热和甲醇处理的脂肪酶体系中加入四氢嘧啶，结果表明四氢嘧啶在保护脂肪酶免受热量和甲醇的影响方面非常有效。脂肪酶和硝酸还原酶常应用于废水处理，Cyplik等[46]研究发现，添加四氢嘧啶后两种酶的相对酶活性分别提高了32%和35%。研究结果表明，四氢嘧啶显著影响脂肪酶和硝酸还原酶的活性，可以作为酶法处理废水问题中的酶保护剂，提高废水的处理效率。

3.1.2  核酸、DNA的保护

四氢嘧啶及其衍生物羟基四氢嘧啶可以诱导DNA结构发生变化，导致许多限制性内切酶不再能够切割DNA[47]。Schnoor等[48]报道，同型四氢嘧啶（homoectoine）提高了富GC模板聚合酶链反应的效率，进而提高了PCR反应的效率。四氢嘧啶可以在辐射条件下保护DNA分子，并且在初级电子和30 keV的高辐射剂量下均具备抑制辐射损伤的能力[49]。另外，四氢嘧啶可以用于新型RNA稳定剂的开发[50]。

吴菊[51]发明了一种含四氢嘧啶的无甘油保存保护剂，此保护剂的添加使核酸诊断试剂冻干制品的成品率和稳定性显著提高，并弥补了传统含甘油保护剂的诸多不足。DNA微阵列（DNA芯片）是重要的基因组学和遗传学的研究工具，具有快速、准确、低成本的生物分析检测能力。Nicoletta等[52]研究证实，低浓度的羟基四氢嘧啶降低了DNA微阵列背景并提高了杂交效率，这一发现为DNA微阵列实验的改进提供了巨大的空间。

3.1.3  其他大分子的保护

Salmannejad等[53]报道，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶可以提高重组人干扰素（Alfa2b）二级结构和构象的稳定性，抑制Alfa2b的热诱导聚集变性，从而提高Alfa2b的热稳定性。Nayak等[54]研究表明，在高温、冷冻和解冻过程中，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶可以稳定喷雾干燥制剂中的抗体，是治疗性抗体的有效赋形剂。Sajjad等[55]报道，四氢嘧啶可作为蛋白质的一种潜在的缓解剂和辐射保护剂，在极端环境中使蛋白质克服辐射和高盐浓度的氧化损伤。此外，四氢嘧啶也可能作为膜蛋白的稳定剂，应用于膜蛋白作为药物靶点的医学研究中[56]。

3.2  四氢嘧啶对细胞的保护

3.2.1  四氢嘧啶对微生物细胞的保护

四氢嘧啶可作为保护剂应用于微生物保存液的开发，有效保护微生物的活性，提高菌体的存活率和活性[57]。四氢嘧啶也可以对根瘤菌生物接种剂的液体制剂进行改良，提高根瘤菌细胞的存活率和培养黏度，改善根瘤菌接种剂的性能[58]。另外，Bownik等[59]研究发现四氢嘧啶具有保护细胞、防御有毒化合物的作用。在运动发酵单胞菌乙醇发酵过程中，四氢嘧啶的添加改善了细胞的生长和细胞对葡萄糖的利用，保护了相关酶[60]。

微生物燃料电池（MFC）可以实现产电和废水净化同时进行，但电池的高盐环境抑制了MFC阳极上产电微生物的生长，导致MFC产电量降低。Tan等[61]研究发现，添加四氢嘧啶可以增加产电微生物的耐盐性，从而增加MFC的发电量。基于此，张苓花等[62]将四氢嘧啶分泌型盐单胞菌作为固定化细胞相设置于传统两极单室MFC中，构建了一种三相单室的MFC，以此增强MFC电极微生物的耐盐性，进而提高了电池的产电效率和脱氮效率。

3.2.2  四氢嘧啶对人体细胞的保护

二甲亚砜（DMSO）是广泛应用于细胞低温保存的冷冻保护剂。但高浓度的DMSO有毒性，对细胞功能有不利影响。Sun等[63]报道，相容性溶质（CS）可以降低DMSO的不利影响，四氢嘧啶可以改善低DMSO浓度下人内皮细胞系HPMEC-ST1.6R的低温保存效果，可以作为冷冻保护剂用于人内皮细胞的冷冻保存。四氢嘧啶被证实可以在低温培养或保存时作为从人脐带血UCB中分离出来的单个核细胞的低温保护剂[64]。

3.2.3  四氢嘧啶对动物细胞的保护

四氢嘧啶对动物细胞的保护作用同样已被证实。Oriquat等[65]报道，四氢嘧啶通过对炎症和氧化应激途径的作用保护辐射应激下的小鼠肝脏细胞。此外，Tsai等[66]研究发现四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶均可使猪视网膜器官培养中细胞免受氯化钴（CoCl2）诱导的缺氧损伤。Bownik等[67]报道，四氢嘧啶具有阻断成孔毒素的能力，保护体外牛红细胞免受葡萄球菌α-溶血素（HlyA）的侵害。 另外，四氢嘧啶對一些无脊椎动物的保护作用也被证实。Bownik等[67]研究表明，四氢嘧啶对大型水蚤乙醇诱导的氧化应激有明显的保护作用。

4  四氢嘧啶的生物保护作用在食品领域的应用

4.1  食品生产中的酶保护剂

四氢嘧啶可作为高效、无毒、安全的麦芽酶热保护剂用于啤酒的生产中。在啤酒酿造过程中，大麦发芽所形成的丰富酶系易在后续的高温干燥工序中受热变性，麦芽酶活性损失较大，直接导致麦芽的酿造性能下降，影响产品的品质。郑昕等[68-69]研究发现，四氢嘧啶对麦芽中的淀粉酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶3种重要的麦芽酶均有明显的保护作用，四氢嘧啶的添加提高了麦芽酶高温干燥后的剩余酶活性，进而改善了啤酒麦芽的酿造性能。

凝乳酶是食品工业中生产乳酪和干酪素所必需的酶，主要功能是水解牛奶中的酪蛋白使牛奶凝结。武彬等[70]研究发现四氢嘧啶是食品工业中理想的凝乳酶热保护剂，并且与其他稳定剂相比具有高效性和安全性。乳过氧化物酶（LPO）对病原微生物具有广谱抗菌活性，是食品工业中的天然生物防腐剂，而四氢嘧啶可作为高温和极端pH下LPO的稳定剂[71]。从辣根中提取的辣根过氧化物酶（HRP-DL）广泛应用于各个领域，四氢嘧啶作为HRP-DL热稳定保护剂效果显著，对HRP-DL在逆向环境中的应用具有重要意义[72]。

4.2  食品生产中菌体细胞的保护剂

Thuoc等[8]研究发现，从虾酱中分离出来的大多数嗜盐细菌都会积累四氢嘧啶以适应高盐浓度引起的低水分活度条件。基于此，研究人员认为四氢嘧啶可以作为发酵菌体细胞的保护剂引入食品体系，从而抑制不利条件对食品中菌体细胞的损伤。

四氢嘧啶可以在冻干处理中保护乳酸菌细胞，基于此，张杰等[73]发明了一种含四氢嘧啶的乳酸菌冻干保护剂。此保护剂对冻干的乳酸菌有显著的保护作用，降低了冻干对乳酸菌的影响，加入此冻干保护剂后所得的乳酸菌菌粉活性高、稳定性强，有利于长期贮存和运输。

李越等[74]研究发现，在冷冻条件下四氢嘧啶可以与面团中的水和蛋白质发生相互作用，从而抑制冰晶对酵母菌细胞和面筋蛋白的損伤，使冷冻面团的结构更稳定。因此，四氢嘧啶可作为一种新型的、天然的抗冻剂用于冷冻面团生产中。

4.3  延长食品保质期

Omara等[75]报道，添加四氢嘧啶可以在酸奶低温储存过程中维持乳酸菌的细胞密度，延长乳制品中乳酸菌的储藏寿命。因此，在乳制品中添加四氢嘧啶等增加益生菌活力的成分或是解决乳制品保质期短的一个可行的方法。

朱道辰等[76]发现在绿豆糕表面喷洒四氢嘧啶和海藻糖混合溶液能够使绿豆糕体系中的游离水络合形成结合水，稳定体系中的水分子，这种绿豆糕保鲜方法在保持绿豆糕松软口感的同时，可以抑制细菌的生长，延长其保鲜期。朱道辰等[77]发明了一种含有四氢嘧啶的月饼添加剂，此添加剂可使月饼维持松软的口感，延长月饼的保鲜期。

4.4  研发功能性食品

四氢嘧啶特殊的生物学功能使其常被应用于功能性食品的研究与开发。朱道辰[78]发明了一种添加四氢嘧啶的解酒、醒酒益生元组合物。此组合物可用于制备保健食品，具有快速解酒、醒酒和消除酒精中毒症状等功能且无毒副作用。董艳美等[79]发明了一种四氢嘧啶类物质的饮用酒，使用四氢嘧啶类物质制备组合物，这些组合物能够有效预防和治疗饮酒引起的醉酒、酒精性肝损伤和肠道菌群失衡。刘玉敏等[80]发明了一种含有四氢嘧啶的复合益生元。研究发现，此种复合益生元可用于调节肠道的功能，应用于调节动物肠道菌群的食品、药品或保健品中。

5  展望

四氢嘧啶是重要的渗透压调节剂，是高效的生物大分子和细胞保护剂，其保护作用始终受到广泛认可。更重要的是作为天然保护剂的四氢嘧啶不会改变生物大分子正常生物学功能，不影响细胞的正常生命活动，可以作为极端条件下生物大分子和细胞优质的保护剂，保护效果十分显著，应用领域十分广阔。目前，科研人员在分子、细胞及组学水平上揭示了四氢嘧啶及其衍生物对生物大分子诸如酶、核酸、蛋白等的保护作用及细胞保护作用机理，在食品工程、生物保护、生物医药及生物科技等领域有了不少研究成果。四氢嘧啶进入国内外市场后引起较高的关注度，市场销售额稳步增长，商业市场存在巨大潜力。但相比于四氢嘧啶商业化的快速发展，四氢嘧啶的生物保护机制尚不明确，且研究零散，尚无确切的结论。保护机制不明确使得四氢嘧啶的使用存在盲目性，十分不利于四氢嘧啶的实际应用。因此，对四氢嘧啶生物保护机制的深入研究至关重要。四氢嘧啶可应用于开发新型食品添加剂，为食品工业赋能，其生物保护作用在食品领域具有广阔的前景，但相比于其他领域，四氢嘧啶在食品领域应用的报道仍较少，应用潜质一直被忽视。因此，需开发四氢嘧啶生物保护作用的新应用，进一步探索四氢嘧啶应用于食品行业潜在的可能性，拓宽四氢嘧啶在食品领域的应用范围。

参考文献：

[1]BROWN A D， SIMPSON J R. Water relations of sugar-tolerant yeasts： the role of intracellular polyols[J].Journal of General Microbiology，1972，72（3）：589-591.

[2]KEMPF B， BREMER E. Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to high-osmolality environments[J].Archives of Microbiology，1998，170（5）：319-330.

[3]PASTOR J M， SALVADOR M， ARGANDONA M. Ectoines in cell stress protection： uses and biotechnological production[J].Biotechnology Advances： An International Review Journal，2010，28（6）：782-801.

[4]张鑫，舒志万，李永臻，等.相容溶质四氢嘧啶的微生物合成研究进展[J].生物工程学报，2022，38（3）：868-881.

[5]PATTERSON D J. Microbial water stress physiology， principles and perspectives[J].European Journal of Protistology，1990，26（2）：195-196.

[6]張山，胡萌，何永志，等.四氢嘧啶微生物合成与应用研究进展[J].微生物学报，2021，61（8）：2250-2263.

[7]BECKER J， WITTMANN C. Microbial production of extremolytes-high-value active ingredients for nutrition， health care， and well-being[J].Current Opinion in Biotechnology，2020，65：118-128.

[8]THUOC D V， LOAN T T， TRA N T. Accumulation of ectoines by halophilic bacteria isolated from fermented shrimp paste： an adaptation mechanism to salinity， temperature， and pH stress[J].Current Microbiology，2021，78（6）：1-2.

[9]李越，辛嘉英，路雪纯，等.四氢嘧啶的生物大分子保护作用研究进展[J].应用化工，2023，52（4）：1231-1236.

[10]SCHWIBBERT K， MARIN-SANGUINO A， BAGYAN I， et al. A blueprint of ectoine metabolism from the genome of the industrial producer Halomonas elongata DSM 2581T[J].Environmental Microbiology，2011，13（8）：1973-1994.

[11]PETERS P， GALINSKI E， TRPER H.The biosynthesis of ectoine[J].FEMS Microbiology Letters，1990，71（1-2）：157-162.

[12]GARCIA-ESTEPA R， ARGANDONA M， REINA-BUENO M， et al. The ectD gene， which is involved in the synthesis of the compatible solute hydroxyectoine， is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens[J].Journal of Bacteriology，2006，188（11）：3774-3784.

[13]GRAMMEL N. Molekulargenetische und biochemische analyse der biosynthese von 2-methyl-4-carboxy-3，4，5，6-tetrahydropyrimidin und seinem 5-hydroxyderivat， zwei salzstre β induzierbaren osmolyten in Streptomyces chrysomallus[D].Berlin：Technische Universitt Berlin，2000.

[14]CANOVAS D， BORGES N， VARGAS C， et al. Role of Nγ-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine[J].Appliedand Environmental Microbiology，1999，65（9）：3774-3779.

[15]ONO H， SAWADA K， KHUNAJAKR N， et al. Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a compatible solute in a moderately halophilic eubacterium， Halomonas elongata[J].Journal of Bacteriology，1999，181（1）：91.

[16]WANG Z B， LI Y Z， GAO X， et al. Comparative genomic analysis of  Halomonas campaniensis wild-type and ultraviolet radiation-mutated strains reveal genomic differences associated with increased ectoine production[J].International Microbiology： the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology，2023，26：1009-1020.

[17]CHEN W C， HSU C C， LAN J C W， et al. Production and characterization of ectoine using amoderately halophilic strain Halomonas salina BCRC17875[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2018，125（5）：578-584.

[18]DONG Y S， ZHANG H， WANG X Y， et al.Enhancing ectoine production by recombinant Escherichia coli through step-wise fermentation optimization strategy based on kinetic analysis[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2021，44（7）：1557-1566.

[19]SALAR-GARCA M J， BERNAL V， PASTOR J M， et al. Understanding the interplay of carbon and nitrogen supply for ectoines production and metabolic overflow in high density cultures of Chromohalobacter salexigens[J].Microbial Cell Factories，2017，16（1）：23.

[20]SU Y， PENG W T， WANG T， et al. Ectoine production using novel heterologous EctABCS. salarius from marine bacterium Salinicola salarius[J].Applied Sciences，2021，11（15）：6873.

[21]CHEN W C， YUAN F W， WANG L F， et al. Ectoine production with indigenous Marinococcus sp. MAR2 isolated from the marine environment[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology，2020，50（1）：74-81.

[22]田磊，張芳，沈国平，等.Ectoine高产菌株Halomonas sp. XH26的鉴定及紫外诱变选育[J].生物学杂志，2020，37（4）：31-35.

[23]WANG D A， CHEN J M， WANG Y， et al. Engineering Escherichia coli for high-yield production of ectoine[J].Green Chemical Engineering，2023，4（2）：217-223.

[24]JIANG A， SONG Y H， YOU J，  et al.High-yield ectoine production in engineered Corynebacterium glutamicum by fine metabolic regulation via plug-in repressor library[J].Bioresource Technology，2022，362：127802.

[25]魏伟伟.大肠杆菌四氢嘧啶合成途径的构建与优化[D].无锡：江南大学，2020.

[26]魏伟伟，王阳，堵国成，等.大肠杆菌四氢嘧啶合成途径的构建与优化[J].食品与生物技术学报，2021，40（7）：30-41.

[27]VCTOR P， LUIS J M， RAQUEL L， et al. Ectoine production from biogas： a sensitivity analysis. Effect of local commodity prices， economy of scale， market trends and biotechnological limitations[J].Journal of Cleaner Production，2022，369：133440.

[28]CANTERA S， PHANDANOUVONG-LOZANO V， PASCUAL C， et al. A systematic comparison of ectoine production from upgraded biogas using Methylomicrobium alcaliphilum and a mixed haloalkaliphilic consortium[J].Waste Management，2020，102（C）：773-781.

[29]王广交，辛嘉英，崔添玉，等.利用甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b生产四氢嘧啶的研究[J].应用化工，2021，50（2）：388-391，399.

[30]王广交，辛嘉英，孙立瑞，等.甲烷氧化菌合成四氢嘧啶的研究进展[J].应用化工，2020，49（6）：1515-1518，1522.

[31]CROWLEY E. Compatible solute ectoine review： protection mechanisms and production methods[J].Journal of Undergraduate Studies Winter，2017，5（1）：32-39.

[32]ANDREAS E， ANDREAS N， SERGEY E K， et al. Hydration and ion binding of the osmolyte ectoine[J].The Journal of Physical Chemistry B，2015，119（49）：15203-15211.

[33]GIOACCHINO M D， BRUNI F， SODO A， et al. Ectoine hydration， aggregation and influence on water structure[J].Molecular Physics，2019，117（22）：3311-3319.

[34]SOLOMUN T， HAHN M B， SMIATEK J. Raman spectroscopic signature of ectoine conformations in bulk solution and crystalline state[J].Chemphyschem，2020，21（17）：1945-1950.

[35]RASTENIENE A， GRUSKIENE R， SEREIKAITE J. Interaction of ectoine and hydroxyectoine with protein： fluorescence study[J].Chemical Papers，2021，75（6）：2703-2712.

[36]ARAKAWA T， TIMASHEFF S N. The stabilization of proteins by osmolytes[J].Biophysical Journal，1985，47（3）：411-414.

[37]YU I， JINDO Y， NAGAOKA M. Microscopic understanding of preferential exclusion of compatible solute ectoine：direct interaction and hydration alteration[J].Journal of Physical Chemistry B，2007，111（34）：10231-10238.

[38]ZACCAI G， BAGYAN I， COMBET J， et al. Neutrons describe ectoine effects on water H-bonding and hydration around a soluble protein and a cell membrane[J].Scientific Reports，2016，6（1）：31434.

[39]HERZOGA M， DWIVEDI M， HARISHCHANDRA R K， et al. Effect of ectoine， hydroxyectoine and β-hydroxybutyrate on the temperature and pressure stability of phospholipid bilayer membranes of different complexity[J].Colloids and Surfaces B： Biointerfaces，2019，178：404-411.

[40]HARISHCHANDRA R K， WULFF S， LENTZEN G， et al. The effect of compatible solute ectoines on the structural organization of lipid monolayer and bilayer membranes[J].Biophysical Chemistry，2010，150（1-3）：37-46.

[41]DWIVEDI M， BRINKKTTER M， HARISHCHANDRA R K， et al. Biophysical investigations of the structure and function of the tear fluid lipid layers and the effect of ectoine.Part B： Artificial lipid films[J].Biochimica Et Biophysica Acta，2014，1838（10）：2716-2727.

[42]VAN-THUOC D， HASHIM S O， HATTI-KAUL R， et al. Ectoine-mediated protection of enzyme from the effect of pH and temperature stress： a study using Bacillus halodurans xylanase as a model[J].Applied Microbiology & Biotechnology，2013，97（14）：6271-6278.

[43]GLLER K， GALINSKI E A. Protection of a model enzyme （lactate dehydrogenase） against heat， urea and freeze-thaw treatment by compatible solute additives[J].Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，1999，7（1-4）：37-45.

[44]SAMANTHA P， GARY J P. Protecting enzymes from stress-induced inactivation[J].Biochemistry，2019，58（37）：3825-3833.

[45]PARWATA I P， WAHYUNINGRUM D， SUHANDONO S， et al. Ability of ectoine to stabilize lipase against elevated temperatures and methanol concentrations[J].Indonesian Journal of Chemistry，2021，21（2）：494-501.

[46]CYPLIK P， PIOTROWSKA-CYPLIK A， MARECIK R， et al. Biological denitrification of brine： the effect of compatible solutes on enzyme activities and fatty acid degradation[J].Biodegradation，2012，23（5）：663-672.

[47]MALIN G， IAKOBASHVILI R， LAPIDOT A. Effect of tetrahydropyrimidine derivatives on protein-nucleic acids interaction. Type Ⅱ restriction endonucleases as a model system[J].The Journal of Biological Chemistry，1999，274（11）：6920-6929.

[48]SCHNOOR M， VOB P， CULLEN P， et al. Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR enhancer[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，322（3）：867-872.

[49]MEYER S， SCHRTER M A， HAHN M B， et al. Ectoine can enhance structural changes in DNA in vitro[J].Scientific Reports，2017，7（1）：7170.

[50]李珍爱，李海军，张英华，等.一种含四氢嘧啶的RNA稳定剂及其应用：中国，CN114214315B[P].2022-08-30.

[51]吴菊.一种无甘油保存保护剂及其应用：中国，CN115232861A[P].2022-10-25.

[52]NICOLETTA M， LIU X P， SIMONA R， et al. Compatible solutes from hyperthermophiles improve the quality of DNA microarrays[J].BMC Biotechnology，2007，7（1）：82.

[53]SALMANNEJAD F，NAFISSI-VARCHEH N.Ectoine and hydroxyectoine inhibit thermal-induced aggregation and increase thermostability of recombinant human interferon Alfa2b[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，2017，97：200-207.

[54]NAYAK P K， GOODE M， CHANG D P， et al. Ectoine and hydroxyectoine stabilize antibodies in spray-dried formulations at elevated temperature and during a freeze/thaw process[J].Molecular Pharmaceutics，2020，17（9）：3291-3297.

[55]SAJJAD W， QADIR S， AHMAD M， et al. Ectoine： a compatible solute in radio-halophilic Stenotrophomonas sp. WMA-LM19 strain to prevent ultraviolet-induced protein damage[J].Journal of Applied Microbiology，2018，125（2）：457-467.

[56]ROYCHOUDHURY A， HAUSSINGER D， OESTERHELT F. Effect of the compatible solute ectoine on the stability of the membrane proteins[J].Protein and Peptide Letters，2012，19（8）：791-794.

[57]楊启文，喻玮，朱盈，等.一种微生物保存液及其使用方法：中国，CN115466682B[P].2023-03-24.

[58]ELSAKHAWY T， GHAZI A， ABDELRAHMAN M A. Developing liquid Rhizobium inoculants with enhanced long-term survival， storage stability， and plant growth promotion using ectoine additive[J].Current Microbiology，2020，78（1）：282-291.

[59]BOWNIK A， STPNIEWSKA Z. Protective effects of bacterial osmoprotectant ectoine on bovine erythrocytes subjected to staphylococcal alpha-haemolysin[J].Toxicon，2015，99：130-135.

[60]ZHANG L H， LANG Y J， WANG C X， et al. Promoting effect of compatible solute ectoine on the ethanol fermentation by Zymomonas mobilis CICC10232[J].Process Biochemistry，2008，43（6）：642-646.

[61]TAN F X， ZHANG L H， LIU W F， et al. Osmotic pressure compensated solute ectoine improves salt tolerance of microbial cells in microbial fuel cells[J].Fuel Cells，2019，19（5）：616-622.

[62]张苓花，曾繁锦，刘伟凤，等.一种微生物燃料电池高盐下高效产电和脱氮的方法：中国，CN109607755B[P].2022-04-29.

[63]SUN H， GLASMACHER B， HOFMANN N. Compatible solutes improve cryopreservation of human endothelial cells[J].Cryo Letters，2012，33（6）：485-493.

[64]AKALABYA B， PRAMANIK K. Effects of non-toxic cryoprotective agents on the viability of cord blood derived MNCs[J].Cryo Letters，2013，34（5）：453-465.

[65]ORIQUAT G A， AMMARI W G. Biochemical effects of low-dose whole body x-irradiationon mouse liver and the protective action of ectoine[J].Tropical Journal of Pharmaceutical Research，2019，17（11）：2207.

[66]TSAI T， MUELLER-BUEHL A M， SATGUNARAJAH Y， et al.Protective effect of the extremolytes ectoine and hydroxyectoine in a porcine organ culture[J].Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology，2020，258（11）：3527.

[67]BOWNIK A， S＇LASKA B， SZABELAK A. Protective effects of compatible solute ectoine against ethanol-induced toxic alterations in Daphnia magna[J].Journal of Comparative Physiology B-Biochemical， Systemic， and Environmental Physiology，2018，188（5）：779-791.

[68]郑昕.四氢嘧啶对澳麦Gairdner和国麦甘啤3号制麦过程的影响[J].食品科技，2011，36（8）：127-131.

[69]郑昕，张苓花.Ectoine提高啤酒麦芽中酶的热稳定性的研究[J].酿酒科技，2009（5）：36-38.

[70]武彬，石天虹，刘雪兰，等.四氢嘧啶对热变性凝乳酶复性作用的研究[J].安徽农业科学，2018，46（3）：137-139.

[71]BOROUJENI M B，NAYERI H.Stabilization of bovine lactoperoxidase in the presence of ectoine[J].Food Chemistry，2018，265：208-215.

[72]WANG T， TIAN J， LI T T， et al. Enzyme properties and thermal stability of horseradish peroxidase （HRP-DL）[C]//International Conference on Engineering and Technology Innovations （ICETI 2016），2016：234-238.

[73]张杰，刘云成，卞辑，等.一种乳酸菌冻干保护剂及其应用：中国，CN104830689A[P].2015-08-12.

[74]李越，辛嘉英，孙莹，等.四氢嘧啶对冷冻面团的保护作用研究[J].食品安全質量检测学报，2023，14（7）：148-154.

[75]OMARA A M A， SHARAF A E M， EL-HELA A A， et al. Optimizing ectoine biosynthesis using response surface methodology and osmoprotectant applications[J].Biotechnology Letters，2020，42（6）：1003-1017.

[76]朱道辰，陈焱，洪好，等.一种延长绿豆糕保鲜期的方法：中国，CN104544471A[P].2015-04-29.

[77]朱道辰，陈焱，洪好，等.一种月饼添加剂：中国，CN104542794A[P].2015-04-29.

[78]朱道辰.一种解酒醒酒益生元组合物：中国，CN107836719A[P].2018-03-27.

[79]董艳美，王冠凤，石艳丽，等.四氢嘧啶类物质的应用及含四氢嘧啶类物质的饮用酒：中国，CN111955727B[P].2022-08-09.

[80]刘玉敏，王冠凤，李梦娇，等.一种复合益生元及其在调节肠道功能中的应用：中国，CN115192602A[P].2022-10-18.