黑平菇及白色变异平菇单核菌株的遗传多样性分析

夏会楠 李东晓 周金看 王春霞 郭金英 郑素月

夏会楠，李东晓，周金看，等. 黑平菇及白色变异平菇单核菌株的遗传多样性分析［J］. 江苏农业科学，2024，52（7）：41-47.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.006

（河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸 056038）

摘要：以筛选平菇杂交过程中优良菌株为目标，分析黑平菇以及白色变异平菇单核菌株遗传多样性。用24个白色变异平菇原生质体单核菌株以及37个黑平菇原生质体单核菌株为试验材料，采用酯酶同工酶技术以及ISSR分子标记技术对其单核菌株进行遗传多样性分析。结果表明，酯酶同工酶白色变异原生质体单核菌株菌株共检测出7条迁移率不同的酶带，黑平菇单核菌株共检测出8条迁移率不同的酶带，多态性条带分别占65.8%、75%；ISSR分子标记技术将平菇白色变异单核菌株以及黑平菇单核菌株的原生质体单核菌株从5个ISSR引物中分别扩增出68、74条清晰的DNA多态片段，多态性位点分别占78.5%、63%。两类聚类分析结果表明，当GS为0.75时，将24个平菇白色变异菌株单核菌株分为两大类；当GS为0.79左右时，将37个黑平菇单核菌株分为两大类。说明酯酶同工酶技术以及ISSR分子标记技术可以用于单核菌株遗传多样性分析，为平菇杂交育种过程中优良亲本单核体的选择提供理论依据。

关键词：平菇；单核菌株；酯酶同工酶；ISSR分子标记

中图分类号：S646.1+40.32  文献标志码：A  文章编号：1002-1302（2024）07-0041-07

平菇是具有食用性和药用性的可食用性大型子实体真菌，生长周期短收益快，且含有人体所需的大量生物活性物质、矿物质和维生素，蛋白质含量高，脂肪含量低，具有非常高的营养价值，已成为人们的重要蔬菜。平菇是典型的四极性异宗结合菌。四极性异宗结合菌，交配型是由A、B这2对因子控制，同一菌株产生的担孢子分为4种不同交配型：A1B1、A2B2、A1B2、A2B1，只有A、B这2个因子各不相同时才能进行交配［1-2］。原生质体单核菌株只有2种交配型。平菇双核菌株通过单核化技术回到质配前的单核状态，是担子菌独特的生物学现象，原生质体单核化是平菇遗传育种上的一个重要节点，单核菌株具有遗传多样性，是研究平菇遗传性状以及基因定位的重要材料，同时单核菌株也为平菇杂交育种提供了重要的种质资源。

酯酶同工酶技术是从蛋白质水平上研究单核菌株之间的遗传差异性，广泛应用于亲缘关系鉴定以及遗传差异研究中［1-2］。但酯酶同工酶仅仅只能从蛋白质水平研究单核菌株遗传差异，不能分析DNA水平上单核菌株遗传差异，因此要更进一步采用ISSR分子标记技术对单核菌株遗传差异性进行研究［3-4］。ISSR分子标记技术是基于SSR发展起来的新技术，具有稳定性及多态性，能够更好地分析单核菌株之间的遗传差异性［5-7］。笔者采用酯酶同工酶以及ISSR分子标记技术对白色变异平菇菌株的24个单核菌株以及黑色出发菌株的37个单核菌株进行遗传多样性分析，以期为食用菌育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2023年2—5月在河北工程大学食用菌研究室内进行，试验所需平菇白色变异菌株是在平菇系统选育过程中发现的白色变异菌株，试验所需变异白平菇原生质体单核体，分别编号为B1～B24，黑色出发菌株原生质体单核体H1～H37，由河北工程大学食用菌研究室鉴定、保藏。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝体培养

将变异的白色平菇以及黑色出发菌株接种于PDA平板上进行培养。

1.2.2 单核菌株收集

通过原生质体制备获得单核菌株，将单核菌株接种至铺有玻璃纸的PDA平板上进行培养，菌丝长满平板后刮取菌丝备用。

1.2.3 酯酶同工酶分析

将备用菌丝放入研钵中，加入液氮快速研磨，取0.5 g菌丝加入700 μL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，混匀后加入离心管19 ℃ 12 000 r/min 离心5 min取上清液。使用DYC2-24EN型双垂直电泳仪进行垂直电泳。

1.2.4 ISSR分子鉴定

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取试剂盒提取单核菌株DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量，进行凝胶成像拍照，剩余DNA放在-20 ℃保存备用，后期进行PCR扩增，扩增体系见表1。所采用的ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 数据分析

利用NTSYS-PC软件进行聚类分析，打开Ntsys 软件中的ntedit.exe程序以及NTSYS-PC程序，用非加权组平均法（UPGMA）构建各菌株的亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 酯酶同工酶分析

2.1.1 白色变异平菇酯酶同工酶

酯酶同工酶分析结果表明，24个白色变异平菇原生质体单核菌株共检测到7条不同迁移率的酶带，相对迁移率（Rf）在0.23～0.63之间，各个单核菌株酶带数量在4～7条，多态性带型占65.8%，部分平菇白色变异单核菌株酯酶同工酶图谱见图1。

2.1.2 白色变异平菇酯酶同工酶聚类分析

聚类分析树状图见图2。由图2可知，供试的24个白色变异平菇单核菌株间的遗传相似系数（GS）为0.6～1.0，当GS为0.685时可将菌株分为2组，根据样本量依次分为A、B 2组。A组为B1、B2等20个菌株，B组为B17、B18、B19、B20等4个菌株。

2.1.3 黑色出发平菇酯酶同工酶分析

酯酶同工酶分析结果表明，37个黑色平菇原生质体单核菌株共检测到8条不同迁移率的酶带，相对迁移率在014～0.47之间，各个单核菌株酶带数量在3～7条，多态性带型占75%，部分黑平菇单核菌株酯酶同工酶图谱见图3。

2.1.4 黑平菇酯酶同工酶聚类分析

由图4聚类分析树状图可知，供试的37个平菇单核菌株间的遗传相似系数（GS）为0.58～1.00，当GS为0.66时可将菌株分为2组，根据样本量依次分为A、B 2组。A组为H1、H2等33个菌株，B组为H13、H14、H15、H16等4个菌株。

2.2 ISSR引物筛选及聚类分析

2.2.1 DNA检测

24株白色變异平菇单核菌株DNA质量检测结果如图5所示，有明显的DNA条带，可进行后续扩增试验。黑色出发菌株部分DNA检测结果如图6所示，有明显DNA条带，可进行后续扩增试验。

2.2.2 ISSR引物筛选

从28个引物（表2）中筛选出5个扩增条带清晰的引物，对24个白色变异单核菌株进行PCR扩增，均能扩增出清晰的条带，分别是P2、P4、P5、P9、P22、P22、P9的扩增图谱分别如图7、图8所示，5个引物对24个平菇白色变异单核菌株共扩增出73条清晰条带。扩增条带最多的引物是P22，扩增条带最少的引物是P5，扩增出14条条带。多态性位点占78.5%。

2.2.3 24个平菇单核菌株的ISSR聚类分析

将24个平菇单核菌株的DNA扩增图谱转化成GS矩阵图，再利用NTSYS-PC软件UPGMA法进行聚类分析，构建单核菌株亲缘关系图。由图9可知，24个单核菌株GS在0.58～1.00之间，当遗传相似系数为0.75时可将24个平菇单核菌株分为两大类，A类有B1、B2等20个菌株，B类有B17、B18、B19、B20等4个菌株，与酯酶同工酶分析结果一致。

2.2.4 黑平菇菌株ISSR引物筛选

从28个引物（表2）中筛选出4个扩增条带清晰的引物（P6、P11、P19、P22），对37个黑平菇原生质体单核菌株进行PCR扩增均能扩增出清晰的条带。P22、P6的扩增图谱分别如图10、图11所示。 4个引物对37个平菇单核菌株共扩增出64个清晰的条带。扩增条带最多的引物是P22，扩增出16条条带，扩增条带最少的是P5，扩增出5条条带。多态性位点占63%。

2.2.5 37个黑平菇单核菌株的ISSR聚类分析

将37个平菇单核菌株的DNA扩增图谱转化成GS矩阵图，再利用NTSYS-PC软件UPGMA法进行聚类分析，构建单核菌株亲缘关系聚类分析图。由图12可知， 供试的37个单核菌株GS在 0.78～1.00之间，当遗传相似系数为0.79时可将37个平菇单核菌株分为两大类，A类有H1、H2等33个单核菌株，B类有H13、H14、H15、H16等4个菌株，与酯酶同工酶分析结果一致。

3 讨论与结论

在生产中，为达到育种目标提高生产力，单核菌株遗传差异研究在食用菌育种中起着非常重要的作用，为平菇杂交育种提供优质的种质资源［8-10］。酯酶同工酶分析、ISSR分子标记技术已经广泛应用于食用菌杂交育种、种质资源鉴定以及单核菌株遗传差异研究［11］。本试验在酯酶同工酶分析的基础上又进行了ISSR分子标记技术进一步研究了白色变异平菇单核菌株遗传差异性，便于挑出优良单核菌株用于育种工作。根据聚类分析图来看，遗传相似性基本一致。酯酶同工酶试验在24个单核菌株中共检测出7条迁移率不同的酶带，多态性带型占658%。24个平菇单核菌株间的遗传相似系数（GS）在0.6～1.0之间，当GS为0.685时可将菌株分为2组，根据样本量依次分为A、B 2组。A组为B1、B2等20个菌株，B组为B17、B18、B19、B20等4个菌株，并且Rf为0.63的条带为24个单核菌株所共有的，可以认为是白色变异平菇单核体的特征谱带。ISSR分子标记技术用筛选出的5条引物对24个平菇单核菌株的DNA进行ISSR扩增，24个平菇单核菌株共扩增出73条清晰条带。扩增条带最多的引物是P22，扩增条带最少的引物是P5，扩增出14条条带，多态性位点占78.5%。当GS为0.75时，将24个菌株分为两大类。平菇黑色出发菌株分别分离出单核菌株37个，平菇黑色出发菌株原生质体单核菌株酯酶同工酶试验共检测出8条迁移率不同的酶带，多态性带占75%。ISSR分子标记技术将平菇黑色出发菌株的原生质体单核菌株从5个ISSR引物中分别扩增出64条清晰的DNA多态片段，多态性位点分别占63%，两类聚类分析结果表明，当GS为0.79左右时，将37个黑色出发菌株分[21]为两大类。酯酶同工酶分析以及ISSR分子标记技术均可以作为单核菌株遗传差异研究的技术手段。通过酯酶同工酶以及分子标记技术研究单核菌株遗传差异大体分类相同之间的小分支还有所差异。ISSR分子标记技术对黑色出发菌株以及白色变异菌株的单核菌株进行了具体的遗传多样性分析，当GS为0.75时，将白色变异菌株24个菌株分为两大类。当GS为0.79左右时，将黑色出发菌株37个菌株分为两大类。酯酶同工酶试验结果表明，平菇黑色出发菌株以及平菇白色变异菌株遗传系相接近，在遗传相似系数在0.75左右能将其分为两大类。综上所述，平菇白色变异菌株的单核菌株遗传多样性不同于黑色出发菌株。这为平菇扩充种质资源库奠定了基础。

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基金项目：河北省高等学校学科技术研究项目（编号：QN2021210）；邯郸市科技技术研究与发展计划（编号：21422012326）；河北省农业科技成果转化项目（编号：202360101010014）。

作者简介：夏会楠（1998—），女，河北承德人，硕士，研究方向为食药用真菌。E-mail：2199797807@qq.com。

通信作者：郑素月，博士，教授，硕士生导师，从事食用菌遗传育种研究工作。E-mail：zhengsuyue@sina.com。