反相高效液相色谱法同时测定五味香连丸中10 种成分含量

吴璐叶，杨正英，于上林

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州 350000）

五味香连丸由黄连、木香、延胡索、吴茱萸、白芍5味药材组方，主要用于治疗肠胃湿热引起的腹痛腹泻、红白痢疾、脓血相杂、里急后重等症，疗效确切［1］。方中，黄连具有清热燥湿、泻火解毒功效，用于肠道炎症及泌尿道感染的活性成分为盐酸小檗碱、巴马汀、黄连碱等生物碱类化合物［2-3］；木香具有芳香健胃、行气止痛功效，用于脾胃气滞证、泻痢等肠胃疾病，主要活性成分为倍半萜类内酯化合物木香烃内酯和去氢木香内酯［4-5］；延胡索具有利气、止痛、活血功效，主要活性成分为延胡索乙素［6-7］；白芍柔肝止痛，主要活性成分为芍药苷［8］；吴茱萸具有散寒止痛、降逆止泻功效，主要用于寒疝腹痛，主要成分为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素［9-10］。现行标准仅用薄层色谱法对黄连和木香进行鉴别，无含量测定项。目前，针对五味香连丸的质量研究仅采用高效液相色谱（HPLC）法测定木香中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量［11］，以及黄连中盐酸小檗碱的含量［12］，难以全面评价制剂的质量。为此，本研究中采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定五味香连丸中盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷10 种成分的含量，为五味香连丸的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配有G1314B 型可变波长检测器（VWD）；XSE-505型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；Milli-Q 型超纯水处理系统（美国Millipore 公司）；KQ-500E 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为50 kHz）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（批号为110713-202015，纯度为85.9%），黄连碱对照品（批号为112026-201802，纯度为94.2%），巴马汀对照品（批号为110732-201913，纯度为85.8%），延胡索乙素对照品（批号为110726-202020，纯度为99.3%），木香烃内酯对照品（批号为111782-201807，纯度为99.6%），去氢木香内酯对照品（批号为111894-202104，纯度为95.1%），吴茱萸碱对照品（批号为110802-202111，纯度为99.8%），吴茱萸次碱对照品（批号为110801-202109，纯度为99.3%），柠檬苦素对照品（批号为110800-201707，纯度为97.9%），芍药苷对照品（批号为110736-202246，纯度为96.7%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；磷酸二氢钾、三乙胺（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水；五味香连丸（北京同鹤药业有限公司，批号分别为20221126，20230109，20230302，每100粒重3 g）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［13-15］与系统适用性试验

色谱柱：Waters SunFire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-含0.02%三乙胺的0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（B，用磷酸调pH 至3.5），梯度洗脱（0～19 min 时15%A →25%A，19～32 min 时25%A →65%A，32～60 min时65%A →78%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：225 nm；进样量：10 µL。理论板数按盐酸小檗碱峰计不低于3 000。取混合对照品溶液适量，按此色谱条件进样测定，结果盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、芍药苷目标峰分离效果良好，分离度均大于1.5。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷对照品各适量，精密称定，加甲醇定容，分别制成每1 mL 分别含0.685 2，0.295 6，0.291 8，0.464 3，0.487 1，0.400 7，0.451 9，0.448 2，0.272 4，0.280 9 mg 的溶液，作为对照品贮备液。分别精密吸取上述对照品贮备液1.0 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

供试品溶液：取样品，研细，取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声处理（功率为500 W，频率为45 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用90%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按样品处方工艺，分别制备缺黄连、木香、延胡索、吴茱萸、白芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下3 种溶液各10 µL，按2.1项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中，盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷色谱峰保留时间与混合对照品溶液一致，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 反相高效液相色谱图1.芍药苷 2.延胡索乙素 3.黄连碱 4.巴马汀 5.盐酸小檗碱 6.柠檬苦素 7.吴茱萸碱 8.吴茱萸次碱 9.木香烃内酯10.去氢木香内酯A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C-G.阴性对照品溶液（分别缺黄连、木香、延胡索、吴茱萸、白芍）Fig.1 RP-HPLC chromatograms1.Paeoniflorin 2.Tetrahydropalmatine 3.Coptisine 4.Palmatine 5.Berberine hydrochloride 6.Limonin 7.Evodiamine 8.Rutaecarpine 9.Costunolide 10.DehydrocostuslactoneA.Mixed reference solution B.Test solution C-G.Negative reference solution（lacking Coptidis Rhizoma，Aucklandiae Radix，Corydalis Rhizoma，Euodiae Fructus，Paeoniae Radix Alba，respectively）

线性关系考察与定量限确定：精密吸取2.2项下各单一对照品贮备液0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5 mL，分别置20 mL 容量瓶中，加甲醇定容，按2.1 项下色谱条件进样测定，分别以各成分峰面积（Y）为纵坐标、相应质量浓度（X，µg/mL）为横坐标进行线性回归；并逐级稀释混合对照品溶液，以信噪比（S/N）为10∶1 时的质量浓度为定量限。结果见表1。

表1 线性关系考察与定量限确定结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test and determination of LOQ（n=6）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷峰面积的RSD分别为0.19%，0.24%，0.32%，0.45%，0.28%，0.51%，0.37%，0.26%，0.31%，0.17%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20230109）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备0，5，10，20，24，48 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷峰面积的RSD分别为0.67%，0.74%，1.02%，0.79%，0.62%，0.81%，0.84%，0.77%，0.93%，0.59%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置48 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为20230109）样品适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷的平均含量分别为1.186 0，0.527 6，0.501 1，0.688 9，0.700 2，0.613 4，0.583 7，0.442 2，0.416 5，0.401 3 mg/ g，RSD分别为0.95%，1.24%，1.46%，1.33%，1.17%，1.09%，1.28%，1.52%，1.61%，1.11%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品6份，研细，取粉末1.0 g，精密称定，按1∶1（m/m）的比例精密加入2.2项下混合对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为20221126，20230109，20230302）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行2 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算样品中盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷的含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of the content determination of 10 components in samples（mg/ g，n=2）

3 讨论

3.1 提取方法选择

考察了不同提取方法（浸渍过夜、超声提取、回流提取）、提取时间（30，40，50 min），最终确定2.2 项下提取方法。

3.2 检测波长选择

对盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、延胡索乙素、木香烃内酯、去氢木香内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素和芍药苷均在200～400 nm 波长范围内进行光谱扫描。结果各成分均在225 nm 波长附近有最大吸收，基线平稳，且理论板数较高，故检测波长选择225 nm。

3.3 色谱条件选择

考察了甲醇、乙腈有机相和不同比例的磷酸二氢钾溶液组成的流动相系统，发现甲醇体系样品中各成分分离时间较长；乙腈体系中10 种待测成分峰形有拖尾现象；添加三乙胺后色谱峰峰形均有改善，当三乙胺体积分数为0.02%时，样品中待测成分色谱峰峰形良好，且各成分均达到完全分离，再增加三乙胺的体积分数，各色谱峰峰形均无明显改善。同时，考察不同色谱柱（Waters SunFire C18柱、Phenomenex Kinetex XB C18柱）、柱温（30，35，40 ℃）对分离效果的影响。最终确定2.1项下色谱条件。

3.4 样品含量测定结果分析

预试验中，测定了样品中黄连活性成分表小檗碱的含量，发现其含量较低，故未作为本研究中含量测定的指标性成分。由表3 可知，同一厂家不同批次产品中10 种成分的含量差异较小，含量从大到小依次为盐酸小檗碱＞木香烃内酯＞延胡索乙素＞去氢木香内酯＞吴茱萸碱＞黄连碱＞巴马汀＞吴茱萸次碱＞柠檬苦素＞芍药苷。

3.4 方法评价

本研究中建立了同时测定五味香连丸中10 种成分含量的RP-HPLC 法，并对3 批样品进行了含量测定，结果显示，10 种成分的平均含量在本检测条件下的范围波动较小，质量稳定。该方法简便可行、结果准确可靠、稳定性好，可用于同时测定五味香连丸中10种成分的含量。