超临界萃取甘草黄酮工艺研究及主要成分分析

王鹏 胥维昌 王远

(沈阳化工研究院，辽宁 沈阳 110000)

引言

甘草属(Glycyrrhiza)是多年生草本植物，隶属于豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoideae)[1]。甘草是我国传统中药，具有镇痰去咳、清热解毒、抗炎、抗变态和抗肿瘤等效果[2]。研究表明，甘草黄酮在上述效果中均发挥着重要作用[3]。由于甘草黄酮种类繁多、含量低、水溶性较差，目前市场上缺少甘草黄酮的相应标准品。超临界二氧化碳萃取技术是一种先进的萃取分离技术，利用超临界CO2流体具有的特殊溶解能力进行天然植物有效成分的提取，较传统溶剂提取具有操作温度低近于室温，压力不高，萃取剂回收方便，临界点容易达到，不污染环境等优点[4]。与以往研究超临界二氧化碳萃取甘草黄酮的试验不同的是，本次试验全面优化了可能对结果产生影响的所有因素，并对萃取液成分进行了分析，分离鉴定主要化合物，对深入研究甘草黄酮的提取分离有重要作用。

1 试验部分

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

10L超临界萃取装置，购于贵州航天乌江机电公司；UV-1800型紫外可视分光光度计，Agilent1260系列液相色谱仪等。

1.1.2 材料

宁夏固原人工种植的乌拉尔甘草，芦丁标准品，纯度99%以上的二氧化碳，其余试剂均购于国药。

1.2 试验方法

1.2.1 甘草总黄酮含量的测定方法

采用硝酸铝比色法测定黄酮含量[5]。以芦丁作为对照标品进行黄酮含量测定，以吸光度为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.2 黄酮萃取率和浸膏中黄酮含量计算

以黄酮萃取率和黄酮含量为标准优化萃取参数，计算公式：

1.2.3 传统溶剂提取

将甘草烘干粉碎，过40目筛，称重后置于烧瓶内，加入70%乙醇，物料比为甘草粉∶70%乙醇=1g∶20mL，85℃热回流提取2h。

1.2.4 超临界萃取工艺流程

将甘草烘干粉碎，过40目筛，称重后进行超临界萃取，待萃取完成后接取萃取液，过滤后测定甘草黄酮萃取率。将萃取液旋蒸烘干至恒重，测定其浸膏中黄酮含量。

1.2.5 工艺优化

1.2.5.1 单因素试验

试验主要考察上样量、携带剂种类、携带剂用量比、萃取温度、萃取压力和萃取时间对甘草黄酮萃取率和浸膏中黄酮含量的影响。

1.2.5.2 正交试验

在单因素试验的基础上选择萃取温度、萃取压力、携带剂种类、上样量为响应变量设计正交试验得到最佳工艺条件。

1.2.6 HPLC分析

利用HPLC对浸膏进行分析，色谱条件为流动相为甲醇(C)和0.1%磷酸水溶液(D)，梯度洗脱程序：20%C和80%D，1min；100%C和0%D，80min；100%C和0%D，90min；20%C和80%D，95min；20%C和80%D，105min。进样量5μL，流速1.0mL·min-1，温度30℃，检测波长210nm。

1.2.7 主要化合物的分离鉴定

通过硅胶柱层析分离浸膏中主要化合物，将分离纯化后的化合物通过核磁共振波谱法鉴定其结构。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

初始萃取条件为上样量200g，萃取时间3h，萃取温度50℃，萃取压力30MPa，携带剂为无水乙醇，携带剂用量比为1g∶5mL。本工艺参数除了在考察影响因素对萃取率的影响而变化外，其余参数固定同上。

2.1.1 上样量的优化

上样量的试验结果见图1a，浸膏中黄酮含量几乎不受上样量的影响；黄酮萃取率随上样量增大而减小，随着上样量增大，二氧化碳和携带剂与甘草粉的接触几率降低而使萃取率下降，在保证萃取率的同时要增大萃取的效率，在该试验条件下选择200g的上样量。

图1 单因素试验结果

2.1.2 携带剂种类优化

携带剂种类优化的试验结果见图1b，黄酮萃取率与黄酮含量的趋势一致，其中氨水与乙醇联合使用时二者同时最高，85%乙醇作为携带剂对甘草黄酮的萃取率高于纯乙醇，水作为携带剂对甘草黄酮的萃取率最低。不加入任何携带剂的超临界二氧化碳流体仅能对极性较低的亲脂性物质及相对分子质量较低的脂肪烃类物质进行萃取，黄酮类物质极性较大，需使用携带剂调节极性。使用水作为携带剂能调节极性，但甘草黄酮水溶性较差，在萃取阶段效果差，在分离阶段要使黄酮溶于水一起流出也会使得萃取率低。黄酮能溶于一定浓度的醇溶液，因此85%乙醇较于纯乙醇极性更大，更加适合甘草黄酮的萃取。氨水与乙醇联合使用对甘草黄酮的萃取率最高的原因是甘草黄酮分子中多为酚羟基，显酸性，易溶于碱性溶液。

2.1.3 萃取温度对甘草黄酮萃取率的影响

萃取温度优化的试验结果见图1c，50℃为甘草黄酮的最佳萃取温度，萃取率达到11.8%，增加或者降低温度都会降低萃取率。随温度升高，分子热运动加快，有效成分扩散、传质速度加快，流体与有效成分缔和机会增加，增大萃取率；温度升高，CO2密度降低，溶解能力下降，使萃取率降低。

2.1.4 萃取压力对甘草黄酮萃取率的影响

萃取压力优化的试验结果见图1d，30MPa为该试验条件下最佳萃取温度，增加或减少萃取压力都会降低甘草黄酮的萃取率。随着萃取压力的增大，二氧化碳的密度也会随之增大，溶解能力增强，传质距离也会减小，甘草黄酮萃取率则相应增加。但随着萃取压力的继续上升，萃取率缓慢增加达到最大值，当压力超过一定值后，二氧化碳的扩散率会下降，萃取率降低。

2.1.5 萃取时间对甘草黄酮萃取率的影响

萃取时间优化的试验结果见图1e，甘草黄酮萃取率随萃取时间的增长而增加，当萃取时间在3h时，甘草中黄酮已基本被完全萃取，继续增长时间黄酮萃取率提升缓慢反而使其他物质被萃取出来，减少黄酮含量并增加试验所需能耗。

2.1.6 携带剂用量比对甘草黄酮萃取率的影响

携带剂用量比优化的试验结果见图1f，浸膏中黄酮含量随着携带剂用量比的增加而增大，甘草萃取率随着携带剂用量比的增大先增大后减少。携带剂的量越多，超临界二氧化碳流体的极性越大，其对黄酮的提取能力越强；过多的携带剂融入二氧化碳流体会使其对其余物质的溶解能力降低。因此，携带剂用量比为1g∶5mL最佳。

2.2 正交试验

根据单因素试验的结果，正交试验进一步优化工艺参数，结果如表1所示。以黄酮萃取率为指标，其最佳萃取工艺为A2B2C2D2，以浸膏中黄酮含量为指标，其最佳工艺条件为A1B3C2D2，由于A1B3与A2B2对黄酮含量影响较小，故确定最佳工艺条件为A2B2C2D2，即萃取温度50℃，萃取压力30MPa，携带剂为乙醇∶氨水=100∶5，上样量为200g。在最佳条件下重复3次试验，平均甘草萃取率为18.8%，平均甘草中黄酮含量为36.74%，符合预期结果。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

2.3 不同提取方法的比较

传统溶剂加热回流提取对甘草黄酮的提取率为43.7%，浸膏中黄酮含量为6.49%。传统溶剂提取的提取率高于超临界二氧化碳萃取，但超临界二氧化碳萃取得到的浸膏中黄酮含量高于传统溶剂提取，便于后续分离纯化。将2种不同提取方法的萃取液在210nm波长下进行HPLC检测，结果如图2所示。超临界二氧化碳萃取富集了化合物一、化合物二、化合物三，较传统提取更具有选择性，利于后续的二次分离。

图2 2种方式提取浸膏液相色谱分析

2.4 结构鉴定

提取化合物的极性相对较低，采用硅胶柱层析对化合物一、化合物二、化合物三进行硅分离纯化，并利用核磁波普鉴定其结构。

2.4.1 化合物一

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：423[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.73(1H，D，H-6′)，6.33(1H，d，H-5′)，6.07(1H，s，H-8)，5.18(2H，m，CH)，4.15(1H，m，H-2)，3.87(1H，m，H-2)，3.32(1H，m，H-3)，3.65(3H，s，OCH3)，3.21，3.25(2H，m，CH2)，2.86，2.70(2H，m，H-4)，1.74，1.64(12H，d，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：157.37(C-5)，154.94(C-4″)，153.40(C-9)，153.41(C-2′)，130.07(C-3″′)，129.74(C-3″)，124.78(C-2″′)，124.14(C-2′)，120.20(C-1′)，116.43(C-3′)，113.61(C-6)，107.66(C-5′)，99.17(C-8)，69.88(C-2)，60.46(C-OCH3)，31.07(C-3)，26.88(C-5″)，26.70(C-4)，26.06(C-2″)，26.03(C-4″′)，22.99(C-1″′)，22.81(C-1″)，18.33(C-5″′)，18.21(C-5″)。以上数据与Fukai等[6]研究结果基本一致，故鉴定化合物一为甘草西定。

2.4.2 化合物二

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：421[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：9.64(1H，s，4′-OH)，9.25(1H，s，8-OH)，6.90(1H，s，H-2′)，6.22(1H，s，H-5′)，6.13(1H，s，H-9)，5.45(1H，d，H-4)，5.20(1H，t，H-2″′)，5.11(1H，t，H-2″)，4.11(2H，m，H-2)，3.78(3H，s，OCH3)，3.14(2H，d，H-2)，2.85(1H，s，H-1″′)，2.69(1H，s，H-1″)，1.59-1.68(12H，d，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：159.94(C-6)，158.55(C-6′)，157.94(C-10)，155.87(C-8)，155.06(C-4′)，131.07(C-3″′)，130.35(C-3″)，125.35(C-2′)，124.21(C-2″′)，124.10(C-2″)，119.77(C-3′)，117.75(C-1′)，115.36(C-7)，106.21(C-5)，99.48(C-9)，97.63(C-5′)，75.46(C-4)，66.40(C-2)，62.61(5-OCH3)，39.20(C-3)，28.31(C-1″′)，26.16(C-5″′)，26.08(C-5″)，22.97(C-1″)，18.31(C-4″)，18.25(C-4″′)。以上数据与王英华等[7]研究结果基本一致，故鉴定化合物二为1-Methoxyficifolinol。

2.4.3 化合物三

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：437[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：9.04(s，1H，6′-OH)，8.20(s，1H，2′-OH)，6.74(d，1H，H-6′)，6.34(d，1H，H-5′)，6.24(s，1H，H-8)，5.15(m，1H，H-2″)，5.08(m，1H，H-2″)，4.13(ddd，1H，H-2)，3.90(t，1H，H-2)，3.71(s，3H，5-OCH3)，3.62(s，3H，7-OCH3)，3.27，3.30(d，2H，1″-CH2)，3.16(m，2H，，1″′-CH2)，2.80(m，1H，H-4)，2.66(dd，1H，H-4)，1.71，1.62(s，12H，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：162.83(C-5)，157.12(C-7)，155.05(C-4′)，153.94(C-2′)，153.52(C-9)，130.13(C-3″′)，128.09(C-3″)，124.45(C-6′)，124.32(C-2″′)，124.14(C-2″)，120.11(C-1′)，116.56(C-3′)，114.72(C-6)，108.67(C-10)，107.77(C-5′)，95.93(C-8)，70.06(C-2)，60.48(5-OCH3)，55.80(7-OCH3)，36.19(C-3)，31.10(C-4)，25.97(C-5″′)，25.90(C-5″)，23.03(C-1″)，22.73(C-1″′)，18.21(C-4″″)，17.98(C-4″)。以上数据与Tahara等[8]研究结果基本一致，故鉴合物三为甘草异黄烷甲。

2.4.4 3种化合物萃取率对比

超临界二氧化碳萃取与传统溶剂提取对化合物一、化合物二、化合物三的萃取率结果见表3，结果表明，超临界二氧化碳萃取是一种高效的针对甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草异黄烷甲的提取方法。

表3 2种方式提取主要化合物萃取率

2.5 结论

超临界二氧化碳萃取针对甘草中甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草异黄烷甲3种化合物的联合提取效果优于传统溶剂提取，是一种高效的提取方法，且提取后浸膏中杂质组成较少，利于后续的分离纯化，是适合用于制作相应标准品的提取方式。超临界二氧化碳萃取更具有选择性，在总黄酮提取方面其提取率不如传统溶剂提取，而针对甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草异黄烷甲3种化合物的提取，超临界二氧化碳萃取在萃取效率与浸膏中物质含量都优于传统溶剂提取，因此超临界二氧化碳萃取更适合对这类物质进行提取。目前超临界二氧化碳萃取主要用于植物挥发油的萃取，其组成成分大多为单萜类化合物，即由2个异戊二烯构成的化合物，该试验发现的结果与其吻合，在甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草异黄烷甲3个化合物的结构中都具备2个异戊二烯基，推断异戊二烯基可能为在超临界二氧化碳中的助溶基团，对含有2个异戊二烯基的化合物的提取分离提供一个新思路。