类器官模型在膀胱癌中的研究进展*

何为 应毅蝶 王茂宇 曾蜀雄 综述 许传亮 审校

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是常见的恶性肿瘤之一，据统计世界范围内每年新发BCa 例数超过57 万，相关死亡病例超过21 万[1]。虽约75% BCa 患者初诊时为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC），但超过60%患者行标准治疗后2 年内出现疾病复发，其中10%～20%患者可进展为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）[2]。在过去几十年中，因BCa 的临床管理和预后几乎无改善，亟需完善可监测BCa 患者的药物疗效和潜在复发的方法，建立反映BCa 生物学特征的肿瘤模型，以指导临床决策，减少治疗不良反应和成本，推动新诊疗手段发展。本文将对类器官在膀胱癌中的优势、建立过程和其临床应用前景与挑战进行综述。

1 肿瘤模型概述

肿瘤模型是机制研究和测试新药的重要平台。2D 细胞系培养、肿瘤动物模型等传统肿瘤模型在研究中的应用已非常普遍。自1907 年Wilson 发现机械分离的海绵细胞能自发形成再生组织以来，动物器官的3D 体外模型经历了漫长的发展过程。近年，以球状体和类器官为代表的3D 体外模型技术逐渐完善，为揭示多种肿瘤（包括BCa）的发病机制和治疗靶点提供了新的有效途径[3]。

1.1 传统肿瘤模型

2D 细胞系培养存在长期体外维持和传代带来不可预测的遗传变异，同时由于缺乏肿瘤起始细胞、缺失人类特异性肿瘤微环境和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等，导致其无法准确模拟人类肿瘤的异质性与复杂性[4]。患者肿瘤来源的异种移植模型（patient-derived xenograft，PDX）虽更加接近临床肿瘤的实际状态，但仍存在动物特异性变异、建模耗时、成本昂贵、伦理学担忧等问题，限制了其在个性化医疗特别是高通量药物筛选中的进一步应用。

1.2 3D 体外模型

3D 体外模型具有多种细胞类型和组织结构，保留了细胞间和细胞与基质相互作用，根据组装方法可分为基于仿生支架的球体培养物、无仿生支架的球体培养物以及患者组织来源类器官（patient-derived organoids，PDO）[5]。球体通常被认为是由细胞间黏附作用形成的简单细胞聚集体，狭义的类器官则起源于组织特异性的祖细胞或干细胞，在基质源性生长因子的作用下，具备自我更新与分化潜能，最终形成更复杂的类器官形态[6]。因在肿瘤相关研究背景中，球体与类器官通常不会行严格区分，本文在后续综述时将统一使用类器官这个术语。目前，针对不同肿瘤类型的类器官培养系统已经成功建立[7]。

1.3 BCa 类器官模型

研究显示，从活检和手术切除的BCa 组织样本构建类器官培养物常用的2 种方法是使小细胞簇在浮动聚集培养物中生长；使单细胞在富含层连蛋白的ECM 凝胶中生长[8]。该研究还发现，培养条件是影响BCa 类器官成功建立的关键因素。Pauli 等[9]研究显示，将BCa 组织样本酶解、离心的单细胞沉淀重悬于含肿瘤类型特异性生长因子的自制原代培养基中，并以1∶2 的体积与ECM 凝胶混合后铺板培育，当活细胞生长为球状结构并可传代至少5 次视为类器官构建成功，但建模效率仅为33%（8/24）。Lee 等[3]研究显示，使用包括木炭剥离的胎牛血清和ROCK 抑制剂等在内的培养基配方，BCa 类器官的建模效率被优化至70%。

支架对BCa 类器官培育具有重要作用。Walz 等[10]研究显示，对天然来源ECM 凝胶支架与聚合物水凝胶支架培养下的BCa 类器官比较结果显示，不同支架之间的类器官大小及基因谱存在显著性差异。此外，肿瘤细胞的来源也可能会影响建模成功率。研究显示，将尿液样本中分离的肿瘤脱落细胞在ECM 凝胶支架中重悬培养，有效生成了尿源性的BCa 类器官，建模效率甚至略高于组织源性类器官，达到83%～85%[11]。Geng 等[12]研究发现，在BCa 类器官早期与晚期传代培养过程中，肿瘤干细胞标志物CD24 表达水平发生改变，提示CD24 可作为细胞扩增潜力延长的指标，有望进一步提高BCa 类器官的传代效率。

目前，BCa 类器官构建技术日益成熟，由于BCa类器官建立的影响因素复杂，实验室间、不同实验需求下的培养条件均可能存在较大差异，且多数详尽的培养方案不会公开，因此BCa 类器官的建立仍然需要面临漫长而持续的优化与标准化。

2 BCa 类器官的临床前价值

传统的临床前模型通常忽略了细胞与基质之间的相互作用，因此无法准确模拟体内环境。BCa 类器官在组织学和功能方面可展现原发肿瘤的特征，以及肿瘤的异质性和形态结构，为不同目的下进行BCa 临床前研究提供了平台[13]。

2.1 肿瘤表型演化

类器官由表达上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和钙黏蛋白E（E-cadherin）等上皮标志物的细胞组成，并能反映肿瘤细胞的不同表型[14]。无论是由细胞簇还是单细胞建立的类器官均可检测到EpCAM 或整合素（integrin）表达。根据上皮标志物表达不同，BCa 类器官表现出基底样或管腔样亚型的特征，并由具有不同分化水平的细胞组成。Mullenders 等[15]研究发现，从同一患者获得的类器官系在分化方面可能有所不同，通过RT-qPCR 检测可确认具有清晰的管腔或基底样亚型的不同类器官系。Lee 等[3]研究显示，在类器官培养过程中，亲本肿瘤中表现出管腔亚型易出现向基底亚型过渡的可逆迹象，其可塑性提示了某些BCa 发生进展的演化过程。将来通过对类器官的直接实验操作、调控肿瘤的克隆演化机制有助于为揭示肿瘤的异质性提供更多线索。

2.2 肿瘤的功能通路

类器官技术成功复现了BCa 的病理特征和分子特性，是深入研究肿瘤机制的可靠工具。Yoshida 等[16]研究显示，在类器官培养条件下，Wnt/β-catenin 信号通路激活能够促进BCa 细胞的增殖和活力。Shen 等[17]利用类器官模型对丝氨酸代谢中的关键酶磷酸甘油脱氢酶（PHGDH）的生物学功能研究发现，PHGDH 可通过与PCBP2 相互作用上调SLC7A11 表达，从而抑制铁死亡并促进BCa 发生发展。Tan 等[18]研究发现，通过对小鼠MIBC 类器官进行CRISPR-cas9 技术操作，验证了介导SIRT1 激动剂SRT1720 对缺氧诱导因子HIF 靶基因的抑制作用，揭示了SIRT1-HIF1α 通路轴。

2.3 肿瘤免疫微环境

PDO 通常保留少部分宿主来源的免疫细胞亚群，是还原肿瘤免疫微环境的候选模型[19]。一种基于声学液滴原理的生物打印平台，利用声场平缓与流体剪切力低的特点以保存液滴中细胞的高活力与基质微环境，并缩短肿瘤类器官的形成时间，将生成的类器官与自体免疫细胞共培养，可于2 天内在体外诱导大量细胞毒性T 细胞，并成功杀伤肿瘤类器官[20]。该技术允许在短时间内重塑肿瘤免疫微环境，以完善对个体患者免疫治疗变异性的预测。

3 BCa 类器官的临床应用

BCa 类器官不仅可用于了解疾病的生物学基础，还可用于创新诊疗方案。目前，BCa 类器官相关的临床研究已处于起步阶段。一项单中心、开放标签的Ⅱ期临床试验（NCT05024734）正在招募中，旨在应用PDO 进行药物筛选，以指导中风险NMIBC 患者的辅助灌注治疗，有望为类器官在BCa 中的应用提供更高级别的循证医学证据[21]。而在临床转化上，已有研究评估了BCa 类器官的临床应用潜力[8]。

3.1 新型肿瘤标志物

Zhang 等[22]研究显示，尿液中的真芽孢杆菌属（Eubacterium sp.）CAG∶581 感染加速了NMIBC 类器官增殖（P＜0.01），并通过转录组测序技术（RNA-Seq）检测Eubacterium sp.CAG∶581 的下游机制，进一步的队列研究验证了Eubacterium sp.CAG∶581 与NMIBC 患者预后的临床相关性，3 年受试者操作特性曲线下面积（AUROC）可达0.79，提示尿道细菌Eubacterium sp.CAG∶581 作为新型无创诊断标志物的潜力。

3.2 药物敏感性

Thorel 等[23]研究显示，PDX 与PDO 模型在药物敏感性预测方面与患者真实治疗反应高度一致。Minoli等[24]对2 例患者的回顾性分析发现，PDO 精准模拟了患者对药物的实际反应，并在体外反映了肿瘤的克隆演变过程，此外，PDO 有望在易复发患者的基线阶段筛选出预防复发的候选药物。尽管如此，由于缺乏算法和软件，对类器官生长分析仍然费力耗时。有研究提出了一个机器学习框架，利用类器官模型衍生的药物基因组数据识别强大的药物生物标志物，该方法准确预测了77 例行顺铂治疗的BCa 患者的药物反应[25]。Zhang 等[26]开发了一种可生成显微图像的BCa 类器官培养系统，并配备基于深度学习的自动图像分割模型（ACU2Net），该模型的敏感度、特异度和F1 分数分别达到94.81%、88.50%和91.54%，可提供更准确的类器官图像分割结果，并提高使用类器官进行药物筛选评估的效率。

3.3 个体化治疗

Murakami 等[27]研究显示，TP53 突变BCa 的PDO对Wee1 抑制剂（MK-1 775）联合顺铂（cisplatin，CDDP）治疗更敏感，而TP53 野生型PDO 对MK-1 775单药和联合CDDP 治疗的疗效相当。Yu 等[28]研究显示，从MIBC 的 PDO 中鉴定出嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的靶抗原黏蛋白1（mucin-1，MUC1），并制备针对MUC1 的CAR-T 细胞，通过PDO 与CAR-T 细胞共培养，建立一个用于评估CAR-T 细胞疗效的体外平台。Garioni 等[29]成功建立了肉瘤样尿路上皮膀胱癌（sarcomatoid urothelial bladder cancer，SarBC）患者衍生的类器官模型（SarBC-01），该模型可长期培养，并模拟原代肿瘤的侵袭性形态、表型和转录特征。该研究通过对高通量药物筛选发现，SarBC 的特异性靶向药物包括针对糖皮质激素受体（GR）途径的药物，展现了类器官技术在罕见肿瘤诊治中的优势。

4 结语

类器官已成为研究BCa 肿瘤异质性、功能通路和免疫微环境的重要工具，可用于生物标志物发现、药物筛选和个体化治疗指导。但类器官技术仍面临着建立、传代、维护成功率低、成本高、培养条件缺乏标准化等挑战。将类器官技术与基因编辑、微流控设备和成像技术相结合，有望克服这些局限性。此外，整合类器官平台与大数据算法和人工智能将推动更强大的临床预测模型的发展，拓展类器官在临床中的应用前景。随着对类器官的深入了解，未来可能建立大规模、可再生的类器官生物资源库，为前沿研究提供有力支持，推动个体化治疗的发展，提升患者的治疗效果。

本文无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。