磷虾油中有机砷脱除工艺优化

方素琼，朱东奇，林锦淮，杨继国，3，4*

（1.仙乐健康科技股份有限公司，广东汕头 515041；2.华南协同创新研究院，广东东莞 523808；3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640；4.岭南现代农业科学与技术广东省实验室河源分中心，广东河源 517000）

南极磷虾油富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等对人体存在重要生理功能的长链多不饱和脂肪酸，其能调节人体的脂质代谢、预防心脑血管疾病、抗癌、降低体脂肪过度积累、促进生长发育和提高幼体的成活率[1-3]，磷虾油中DHA 和EPA 主要结合在磷脂上[4-6]，磷虾油中磷脂型的DHA 和EPA 生物利用度高于甘油三酯型和乙酯型[7-9]，磷虾油中还含有天然类胡萝卜素、虾青素[10-11]。考虑到磷虾油中不饱和脂肪酸易氧化及虾青素受热易分解等特性，磷虾油的加工应尽量控制在较低温度条件下进行。亚临界流体技术具有工作压力低、工作温度相对较低、运作环境为真空状态、溶剂易回收等特点，适于进行磷虾油脱砷工艺，可以对磷虾油中热敏性强、易氧化等的成分进行保护[12-17]，而且，亚临界状态下的分子扩散性能增强，传质速度加快[18-19]。

随着现代工业的发展，海水中砷含量增加，南极磷虾又以海中浮游动植物为食，这也导致其体内的砷越来越多，且后续加工时也会在不同程度上使砷进一步被富集，因此南极磷虾制品尤其是南极磷虾油中总砷含量较高。南极磷虾中的砷主要是有机砷，对磷虾油中砷形态分析可知，磷虾油中无机砷主要为砷酸[arsenic acid，As（Ⅲ）]和亚砷酸[arsenious acid，As（Ⅴ）]，有机砷主要为砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）、砷胆碱（arsenocholine，AsC）、一甲基砷（monomethylarsonic，MMA）、二甲基砷（dimethylarsinic，DMA）砷糖和砷脂。砷甜菜碱是一种亲水双离子型四元烷基砷化合物，占总砷含量90%左右[20-22]，同时，磷虾油中还含有一些脂溶性有机砷[23]。

目前，关于南极磷虾精深加工的研究多集中于磷虾油的提取、精炼、南极磷虾中氟的脱除，或重点研究砷形态，而对磷虾油中砷脱除方法鲜有研究[24]。活性炭化学性质稳定，孔隙结构丰富，比表面积大，吸附能力强，价格便宜[25]，现有研究表明，可利用活性炭吸附除去水体中的重金属[26-27]。本研究以不含无机砷的南极磷虾油为原料，选用椰壳活性炭吸附和水为脱除剂，对磷虾油中有机砷进行脱除，以期为今后磷虾油多种方式相结合脱除有机砷提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磷虾油：青岛康镜海洋生物科技有限公司[总砷含量：（4.10±0.11）mg/kg，无机砷含量：未检出]；椰壳活性炭：深圳市兴万邦活性炭有限公司；正己烷、丙三醇、1，2-丙二醇（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；硝酸、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；丁烷（分析纯）：佛山市科的气体化工有限公司；砷（标准品）：中国计量科学研究院。

1.2 仪器与设备

BS201S Sartorius 精密天平：德国赛多利斯集团；TGL20 台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；700X 电感耦合等离子质谱仪（IPC-MS）：安捷伦科技（中国）有限公司；JTWB-16 密闭式智能微波消解仪：上海屹尧仪器科技发展有限公司；CBE-1L 型亚临界流体萃取设备（丁烷溶剂，1L 定制款）：河南亚临界萃取技术有限公司；5GV-3-K 搅拌机：香港松下电机集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 磷虾油中有机砷的脱除单因素试验

1.3.1.1 脱除剂对磷虾油中有机砷脱除的影响

称取100 g 磷虾油置于亚临界萃取罐内，在脱砷温度为45 ℃、脱砷时间为3 h 条件下，考察脱除剂单独使用和同时使用对磷虾油中有机砷脱除的影响。设置只添加椰壳活性炭（添加量3%）、只添加水（添加量30%）、同时加入3% 椰壳活性炭和30% 水（各添加量均以磷虾油计），关闭进料口，抽真空至-0.1 MPa，加入丁烷溶剂，打开搅拌机搅拌至3 h 后停止搅拌，静置，待分层后，将上层溶剂相通过管道输送至溶剂回收罐内，回收丁烷溶剂，用正己烷洗出萃取罐中的混合物，过滤除去吸附剂，除水，回收正己烷，得到除砷后的磷虾油，检测总砷含量，计算脱砷率。

1.3.1.2 脱砷温度对磷虾油中有机砷脱除的影响

设置脱砷温度为35、40、45、50、55 ℃，同时加入3%椰壳活性炭和30%水，后续处理参考1.3.1.1，考察不同脱砷温度对磷虾油中有机砷脱除的影响.

1.3.1.3 椰壳活性炭添加量对磷虾油中有机砷脱除的影响

设置脱砷温度为45 ℃，加入30%水，再分别加入3%、5%、7%、9%、11% 椰壳活性炭，后续处理参考1.3.1.1，考察椰壳活性炭添加量对磷虾油中有机砷的脱除的影响。

1.3.1.4 水添加量对磷虾油中有机砷脱除的影响

设置脱砷温度为45 ℃，加入9% 的活性炭，再分别加入25%、30%、35%、40%、45%、50% 水，后续处理参考1.3.1.1，考察水添加量对磷虾油中有机砷的脱除的影响。

1.3.1.5 脱砷时间对磷虾油中有机砷脱除的影响

设置脱砷温度为45 ℃，同时加入9%椰壳活性炭和40%水，脱砷时间分别为1、2、3、4、5、6 h，后续处理参考1.3.1.1，考察脱砷时间对磷虾油中有机砷的脱除的影响。

1.3.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上，考虑磷虾油中含有热敏性、易氧化等物质，为确保磷虾油脱砷后的品质，脱砷温度不宜过高，因此选取椰壳活性炭添加量（A）、水添加量（B）、脱砷时间（C）作为变量，脱砷率（Y）为响应值，设计响应面试验，因素和水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.3 磷虾油有机砷脱除率的计算

总砷的测定参照GB 5009.11—2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》中的方法进行测定。磷虾油经检测，无机砷含量未检出，为0 mg/kg，总砷含量即为有机砷含量。有机砷脱砷率（T，%）计算公式如下。

式中：A0为初始磷虾油中总砷含量；At为脱除后磷虾油中总砷含量，mg/kg。

1.3.4 有机砷脱除前后磷虾油质量指标检测

色泽、透明度参考GB/T 5525—2008《植物油脂透明度、气味、滋味鉴定法》中的方法进行测定。

磷脂含量参考GB/T 5537—2008《粮油检验磷脂含量的测定》中的方法进行测定。

酸价参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》中的第二法进行测定。

过氧化值参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》中的第一法进行测定。

DHA、EPA 含量参考GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》中的第一法进行测定。

虾青素含量参考美国药典《磷虾油》中的方法进行测定。

1.4 数据分析

所有数据均重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。数据采用Design-Expert 13 进行分析处理。运用Design-Expert 13 进行响应面图表绘制，其他图表使用Origin 8.5 及Excel 进行绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 脱除剂对磷虾油中有机砷脱除的影响结果

脱除剂对磷虾油中有机砷脱除的结果如图1 所示。

图1 脱除剂对磷虾油脱有机砷的影响Fig.1 Effect of removal agent on removal of organic arsenic in krill oil

由图1 可知，椰壳活性炭+水组、水组、椰壳活性炭组的脱砷率依次为32.43%、20.97% 和9.76%，椰壳活性炭与水同时使用脱砷效果最佳。于树芳[26]、钟福隆等[27]研究表明，活性炭可用于砷的脱除；砷甜菜碱是磷虾油中有机砷的主要物质，具有亲水性[22]，水能脱砷可能是砷甜菜碱溶解于水中后被脱除，考虑到磷虾油中砷的形态及脱除难度[23]，后续试验采用椰壳活性炭和水同时添加进行脱除。

2.1.2 脱砷温度对磷虾油中有机砷脱除的影响结果

脱砷温度对磷虾油中有机砷脱除的影响如图2所示。

图2 脱砷温度对磷虾油脱有机砷的影响Fig.2 Effect of arsenic removal temperature on organic arsenic removal in krill oil

由图2 可知，磷虾油中有机砷的脱砷率随着脱砷温度的升高呈现出先增加后降低的趋势，当脱砷温度为45 ℃时，有机砷脱砷率为32.43%，主要原因是活性炭随着脱砷温度的增加，导致吸附能力减弱，这与活性炭的吸附动力学一致[26，28]。因此，选择脱砷温度为45 ℃进行后续试验。

2.1.3 椰壳活性炭添加量对磷虾油中有机砷脱除的影响结果

椰壳活性炭添加量对磷虾油中有机砷脱除的影响如图3 所示。

图3 椰壳活性炭添加量对磷虾油有机砷脱除的影响Fig.3 Effect of addition of coconut shell-activated carbon on removal of organic arsenic in krill oil

由图3 可以看出，当椰壳活性炭的添加量从3%增加至9%时，磷虾油中有机砷脱砷率从32.43%升至46.34%，继续增加椰壳活性炭添加量，磷虾油中有机砷不再减少，考虑到磷虾油中有机砷存在多种形态，尤其还含有脂溶性有机砷，吸附脱除难度大，活性炭可能只会吸附某些形态的有机砷，当可吸附形态的有机砷被吸附后，其他形态的有机砷因无法被吸附，随着活性炭添加量过多，使得颗粒堆积并造成吸附位点的重叠与聚集，导致活性炭的总活性位点减少从而导致吸附量减少[29]，所以无法进一步将磷虾油中其他形态的有机砷脱除。因此，选择椰壳活性炭添加量7%、9%、11%进行响应面优化试验。

2.1.4 水添加量对磷虾油中有机砷脱除的影响结果

水添加量对磷虾油中有机砷脱除的影响如图4所示。

图4 水添加量对磷虾油有机砷脱除的影响Fig.4 Effect of water addition on removal of organic arsenic in krill oil

由图4 可知，随着水添加量的增加，磷虾油中有机砷脱砷率升高，当水添加量为40% 时，磷虾油中有机砷脱砷率达到58.39%，继续增加水添加量，有机砷脱砷率不会继续增高，这主要原因可能是磷虾油中砷甜菜碱已经溶解至水中，其他形态的有机砷，尤其是脂溶性的有机砷无法溶解至水中[23]，导致脱砷率不增加，因此，选择水添加量35%、40%、45% 进行响应面优化试验。

2.1.5 脱砷时间对磷虾油中有机砷脱除的影响结果

脱砷时间对磷虾油中有机砷脱除的影响如图5所示。

图5 脱砷时间对磷虾油有机砷脱除的影响Fig.5 Effect of arsenic removal removal time on removal of organic arsenic in krill oil

由图5 可知，随着脱砷时间的延长，磷虾油中有机砷脱砷率升高，当脱砷时间到5 h 后，脱砷率增加缓慢，一方面，可溶于水中的有机砷已经被最大程度地溶解至水中，另一方面，活性炭吸附位点已经被占领，导致有机砷无法进一步被吸附，或者其他形态的有机砷无法溶解于水或无法被活性炭吸附，使整个脱砷过程达到动态平衡[27]。因此，选择脱砷时间4、5、6 h 进行响应面优化试验。

2.2 磷虾油有机砷脱除响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

根据1.3.2 和Box-Behnken 的中心组合设计原则，设计了三因素三水平试验方案，结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 建立回归模型及方差分析

根据表2 的结果，利用Design-Expert 13 软件对试验结果进行回归拟合，所得回归方程为Y=68.39+1.60A+2.85B+3.04C+0.0250AB+1.18AC-0.1550BC-1.30A2-3.03B2-4.02C2。

对磷虾油中有机砷脱除试验的回归方程模型进行方差分析，并检验其模型系数的显著性，其结果如表3所示。

表3 响应面模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface model

由表3 可知，回归模型P值＜0.000 1，达到极显著水平，失拟项P=0.774 3，表现为不显著，说明回归模型良好。另外得出模型的决定系数R2=0.993 7，调整后决定系数R2Adj=0.985 5，表示回归模型与预测值之间的拟合度好，在试验条件范围内能明确反映脱砷率的变化，因此可以利用上述方程模型对磷虾油中有机砷最优脱除工艺进行分析和预测。一次项中A、B、C，二次项中A2、B2、C2影响均极显著（P＜0.01），交互项中AC影响显著（P＜0.05），以及由F值大小可判断出3 个单因素对脱砷率的影响顺序为C（脱砷时间）＞B（水添加量）＞A（椰壳活性炭添加量）；交互项影响大小为AC＞BC＞AB；二次项影响大小为C2＞B2＞A2。

2.2.3 响应面分析

椰壳活性炭添加量、水添加量和脱砷时间的交互作用对磷虾油中有机砷脱砷率的影响如图6 所示。

图6 因素间交互作用对磷虾油中有机砷脱除影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface diagram and contour diagram of interactions between factors on removal of organic arsenic in krill oil

图6 反映了椰壳活性炭添加量、水添加量和脱砷时间相互作用对磷虾油有机砷脱除的影响。在等高线图中，如果两个因素之间的交互作用较弱，则等高线更接近圆形；如果交互作用较强，则等高线更接近椭圆形。在响应面图中，如果曲面较陡峭，则响应值的变化幅度较大，表明两个因素之间的交互作用较强。磷虾油有机砷脱砷率在三因素所设定的水平范围内均存在最高值。

2.2.4 最优组合和验证试验

通过模型预测，得到磷虾油有机砷脱除的最佳工艺条件为椰壳活性炭添加量9.81%、水添加量39.25%、脱砷时间5.49 h，在此工艺条件下磷虾油有机砷脱除率为68.71%。结合实际操作情况，将最优方案调整为活性炭添加量10.0%、水添加量39.0%、脱砷时间5.5 h，在上述条件下测定有机砷脱砷率，重复5 次，结果如图7 所示。

图7 磷虾油中有机砷脱除最优组合验证重复试验Fig.7 Repetitive verification of optimal combination of organic arsenic removal in krill oil

由图7 可知，利用椰壳活性炭吸附同时加上水溶解脱除磷虾油中有机砷，磷虾油中的有机砷脱砷率达到（68.68±0.91）%，与预测值相近，重复性好，表明该模型达到预期效果，具有可行性。

2.3 磷虾油有机砷脱除前后主要质量指标

脱除前后磷虾油的主要质量指标结果见表4。

表4 磷虾油有机砷脱除前后质量指标Table 4 Quality indexes before and after removal of organic arsenic in krill oil

由表4 可知，利用椰壳活性炭与水同时添加的方式脱除磷虾油中有机砷，脱除后磷虾油样品各项主要质量指标与脱除前没有明显变化，主要指标磷脂和虾青素并未因处理而有所损失，说明在亚临界流体丁烷体系下，对磷虾油中的一些敏感物质存在保护作用。

3 结论

本研究以不含无机砷的磷虾油为原料，以有机砷脱的砷率为指标，通过单因素和响应面优化，得到最优脱除有机砷的工艺条件为椰壳活性炭添加量10.0%、水添加量39.0%、脱砷时间5.5 h。在最佳条件下，磷虾油中有机砷由初始的4.10 mg/kg 降低至1.28 mg/kg。通过试验重复验证，磷虾油中有机砷脱砷率为68.68%，对脱砷前后磷虾油主要质量指标进行检测，磷脂、虾青素含量、酸价、过氧化值等指标没有明显变化。本研究选用椰壳活性炭和水作为脱除剂、同时添加的方式，在不破坏磷虾油主要质量指标前提下，可以对磷虾油中有机砷进行稳定脱除，为磷虾油中有机砷的脱除提供参考依据。