红甜菜根中类黄酮类差异代谢物的比较分析

白雯钰，刘乃新*，韩广源，于清涛,，周芹，陈百翠，李承欣

(1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨 150080)（2.哈尔滨海关技术中心，黑龙江哈尔滨150023）（3.哈尔滨市农业科学院，黑龙江哈尔滨 150029)

近年来，随着人们对高品质蔬菜的需求日益提升，复合型多功能蔬菜逐渐出现在大众视野，成为植物营养研究热点。红甜菜(Beta vulgarisL.)，藜科，是原产于地中海地区的重要蔬菜，在欧洲、北美洲和亚洲产量最高，全世界都有消费[1]。作为重要的健康食品，人们普遍以红甜菜的紫红色根部为主要食用部分。红甜菜由于含有甜菜素、类黄酮和多酚等多种次生代谢产物而被用于医药领域，甜菜素是红甜菜的主要次生代谢产物之一，是一种水溶性含氮天然色素，由于具有抗菌和抗病毒的特性，被广泛用作食品工业的着色剂[2]。有研究表明，甜菜红色素和酚类化合物具有抗菌、抗炎、抗溃疡、抗肿瘤、抗细胞毒性和调节免疫和保护肝性能的作用[3-5]。甜菜根还对胃肠消化具有有益作用，与其膳食纤维的含量有关，可改善肠道蠕动，减少结肠病变发生率，并可调节肠道菌群[6]。

类黄酮类化合物是一类多酚类化合物，具有很强的抗细菌和抗真菌作用[7]。到目前为止，已发现的黄酮种类已达到4 000 多种，因其在人类疾病治疗中具有潜在抗菌作用，从而在医药领域被广泛应用[8]。类黄酮，目前是指由一个中心三碳连接的两个苯环（a 环和C 环）形成C6-C3-C6 主母核的广泛天然产物[9]。根据其化学结构被分为不同的类别，主要类别包括异黄酮、黄烷醇、黄酮、花青素和查尔酮[10]。在可食用植物中发现的具有丰富生物活性的成分是类黄酮类化合物和酚类化合物，它们在细胞中作为非酶抗氧化剂，以防止氧化应激的损害，是支持人体健康的代谢产物[11]。此外，这些植物化学物质可以作为紫外线过滤器，保护植物免受紫外线辐射的伤害，还可作为信号分子、防御抗菌的化合物和有毒重金属的螯合剂[12]。虽然人们对类黄酮类化合物抗氧化活性的研究较为深入和系统，但关于类黄酮类化合物的种类、含量及变化规律与红甜菜块根代谢间的内在联系却鲜见报道。

本试验以探究一品红和俄罗斯红甜菜块根中类黄酮类次生代谢物质作为切入点，分析两种栽培型红甜菜类黄酮类物质的种类、含量及倍数差异。采用了高效液相色谱-二极管阵列法（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array，HPLC-DAD）、高效液相色谱-质谱法（High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）[13]以及核磁共振光谱和超高效液相色谱-电喷雾电子-飞行时间-质谱等方法，并通过上述方法评价了其中的抗氧化特性。利用主成分分析法（Principle Component Analysis，PCA），正交偏最小二乘法判别分析法（Orthogonal Partial Least Square-Discriminate Analysis，OPLSDA）[14]，对不同阶段类黄酮类化合物进行判别分析，通过聚类分析不同模式条件下红甜菜块根中类黄酮类化合物的组成及含量的分布规律，并对关键黄酮代谢物进行筛选。目前己有报道，甜菜中含有较丰富的皂苷成分，并且在叶甜菜和根甜菜中现己发现11 种三萜皂苷。甜菜中已被明确化学名称的代谢产物有260 个，其中包括定性可靠的差异代谢物99种[16]。在前人的研究中，并没有出现俄罗斯红和一品红甜菜块根中具有显著差异的代谢产物在人体健康方面的功效的推测与研究。而本研究则通过分析两种红甜菜间代谢产物的差异，寻找出具有显著差异的代谢产物，为培育具有特殊活性成分的新的甜菜品种提供研究基础，并对理解不同红甜菜块根中类黄酮类差异代谢产物的分析具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红甜菜块根供试材料为东北地区主栽种一品红（Two CK）及俄罗斯红（Three CK），分别由哈尔滨工业大学程大友教授团队和国家糖料产业技术体系东北育种岗位团提供。2022 年4 月28 日播种，同年10 月8 号收获。种植于哈尔滨市农业科学院试验田。于收获期各品种分别取长势一致6 个块根作为试验材料，每个块根斜45 度角取1 cm 直径条后混合储存于-80 ℃冰柜待用。

1.2 试剂与仪器设备

甲醇（Methanol）、乙腈（Acetonitrile）、醋酸铵（Ammonium Acetate）、氨水（Ammonium Hydroxide）纯度都为LC-MS 级，CNW，L-2-氯苯内氨酸（2-Chloro-L-Phenylalanine）纯度大于等于98%。

安捷伦1290 UHPLC 超高效液相，色谱为购自Waters 的UPLC BEH Amide 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），UPLC BEH 酷胺柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，水）连接到Triple Tof5600（Q-TOF，AB Scicx），赛默飞世尔科技Heracus Fresco17 离心机，Sartorius 天平（BSA124S-CW），Merck Millipore纯水仪（明澈D24 UV），深圳市雷德邦电子有限公司超声仪（PS-60AL）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集和预处理

生物样品放置于冻干机中真空冷冻干燥；用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）直到粉末状；称取50 g 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每过30 min 就需要涡旋一次，每次持续30 s，涡旋6 次。离心（12 000 r/min，3 min）后，吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm Pore Size）过滤样品，再放入样品瓶中保存，用UPLC-MS/MS 检测[15]。

1.3.2 代谢物提取

本试验中两种类型甜菜代谢组测序由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成，相关分析在迈维云平台完成[16]。样品处理：不同甜莱样品在冰上4 ℃解冻，再取100 μL 样品置于EP 管中，用300 μL 甲醇萃取,然后加入20 μL 内标物，旋涡30 s，以超声处理10 min，-20 ℃放置1 h，蛋白质沉淀，然后以13 000 r/min 的速度在4 ℃，离心15 min[16]，再将200 μL 上层清液转移到新鲜的2 mL LC/MS 玻璃小瓶中，从每个样品中各提取20 μL 作为质控样品，并收集上清液用于UHPLC-QTOF-MS 分析。

1.3.3 数据评估

为了使实验的数据准确可靠，我们会在检测试验样品的同时检测质控样本（Quality Control，QC），在数据代表相同的实验条件下，得出仪器的稳定性与精确性，以此来支持实验得出的结论。本实验采用了QC 样本ESI-模式下的总离子流图（Total Ion Chromatograph，TIC）比对和PCA 两种方法对实验中采集的QC 样本数据进行分析[16]。

1.3.4 检测分析

安捷伦1290 超高效液相，色谱为购自Waters公司的UPLC BEH Amide 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），使用UHPLC 系统（1290，安捷伦技术公司）进行LC-MS/MS 分析，将UPLC BEH 酷胺柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，水）连接到Triple Tof 5600（Q-TOF，AB Scicx）上，流动相由25 mmol/L NH4OAC 和25 mmol/L NH4OH 组成，在pH 值9.75的水中（a）和乙腈（b）进行洗脱，洗脱梯度如下：0 min，95% b；7 min，65% b；9 min，40% b；9.1 min，95% b；12 min，95% b，以0.5 mL/min 输送[16]。注入量为3 μL。

电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）的温度为500 ℃；离子喷雾电压（IS）为5 500 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）；离子源气体1（GS1），气体2（GS2）和气帘气（CUR）分别设置为50、60 和25 psi，碰撞气体（氮气）设置为中等。然后使用去簇电压（Declustering Potential，DP）和碰撞能（Collision Energy，CE）进行优化，最后完成各个多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）离子对的DP 和CE。同时再依据每个时期内洗脱的代谢物来检测每一组特定的MRM 离子对[17]。数据采集仪器主要包括UPLC 和串联色谱（Tandem Chromatography，MS/MS）。

1.3.5 数据分析

采取将P值、差异倍数和OPLS-DA 模型的VIP 值融合的方式来选择差异代谢物，筛选的标准为FC＞2、FC＜0.5、Pvalue＜0.05 和VIP＞1[18]。通过主成分分析（PCA）分析样本，了解各组样本间总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。

1.3.6 代谢物定性定量方法

依据迈维代谢MWDB 数据库，根据二级谱得到的信息对物质进行定性分析。代谢物的定量是通过三重四级杆质谱的MRM 来进行分析。以代谢物色谱峰的峰面积积分获得各成分的相对含量，并对同一个代谢物在各个样品中的质谱出峰进行面积积分的矫正。

2 结果与分析

2.1 样本质控分析

由此图我们可以看出总离子流图当中的峰值纯度很高，能够达到实验数据后期的分析要求。

图1 QC 样品正离子流图Fig.1 Sample positive ion flow diagram

图2 QC 样本负离子流图Fig.2 Sample negative ion flow diagram

2.2 主成分分析（PCA）

通过对样本的质控组样品的主要因素研究，能够进一步掌握各样品间的总体代谢物变化以及各样品间的变化率等。PCA 结果显示各组之间代谢组呈现出分离的趋势，这可以提示样品组内代谢组是否存在差异，PCA 得分如图3 所示。

图3 PCA 得分图Fig.3 PCA score plot

图4 OPLS-DA 得分图Fig.4 OPLS-DA score chart

2.3 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA 结合OSC 和PLS-DA 方法，把X 矩阵数据分解成和Y 有关和不相关的2 个数据，通过消除不相关的差异来筛选不同变量。

2.4 一品红和俄罗斯红甜菜块根中类黄酮类代谢产物分析

我国在之前的研究中很少出现对红甜菜块根中的次生代谢物的研究，如黄酮、多酚类、皂苷和萜类化合物等，但国外对此的研究却较为丰富。皂苷成分在抗氧化[19]、消除炎症[20]和降低血糖[21]等多方面的具有良好的作用。本研究明确了两种红甜菜块根中具有代表性的代谢产物，分别为亚二甲氧基黄酮、芹菜素、木犀草素、槲皮素、杨梅素、山奈酚等，其中侧链含有亚二甲氧基的类黄酮类化合物含量最多。一品红与俄罗斯红中黄酮的代谢产物共有69 种，分成六大类，分别是查尔酮、黄酮、其他类黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、橙酮类。其中查尔酮共有2 个，黄酮31 个，其他类黄酮10 个，黄酮醇23 个，二氢黄酮2 个，橙酮类1 个为6-O-β-D-葡萄糖基海生菊（(Z)-6-O-β-D-glucopranosyl-6,7,3,,4,-tetrahydroxyaurone）。以下两种红甜菜之间的比对均以P值作为阙值标准，可判断出差异代谢产物共29种，差异代谢产物中下调的共有17 个（见表1），上调的共12 个（见表2），无差异的成分有40 种（见表3）。

2.4.1 不同品种红甜菜块根中查尔酮类代谢产物分析

查尔酮具有由两个酚环组成的三碳α,β-不饱和羰基体系。许多查尔酮类化合物具有广谱的生物活性，可用于治疗肿瘤[22]，抗宫颈癌等[23]，对多种疾病具有临床应用潜力。它们通常大量存在于大多数可食用植物的种子、果皮、树皮和花中[24]。两种红甜菜品种中有2 种查尔酮成分，分别是3,4,2’,4’,6’-五羟基查耳酮-4’-O-葡萄糖苷和醌式红花苷*。一品红块根中3,4,2’,4’,6’-五羟基查耳酮-4’-O-葡萄糖苷含量显著高于俄罗斯红甜菜（log2FC:-4.64E+00）。

2.4.2 不同品种红甜菜块根中黄酮代谢产物分析

由图5 可知，两种红甜菜品种中有31 种黄酮成分，这31 种黄酮成分大体分为金圣草黄素、甲氧基黄酮、香叶木素、芹菜素、牡荆素、高车前素、川陈皮素、买麻藤乙素、卷柏石松素等物质的衍生物。根据成分差异分析表明：一品红块根中高于俄罗斯红块根的类黄酮类成分有4 种，分别是金圣草黄素、甲氧基黄酮类衍生物、香叶木素、买麻藤乙素。一品红中金圣草黄素和侧链含有亚二甲氧基黄酮类衍生物的含量都高出俄罗斯红5 倍以上，因金圣草黄素其具有抗过敏、抗炎、抗癌等活性[25]，可推测出一品红在此方面的功效优于俄罗斯红。有研究表明，侧链含有亚二甲氧基的类黄酮类衍生物在植物中广泛分布，在抑菌[26]、抗炎[27]、抗氧化[28]等方面有显著的生物活性，因此可推断此成分在这两种红甜菜块根中产生较为明显的影响。芹菜素存在于蔬菜、植物及多数饮料中，芹菜、欧芹中含有大量的芹菜素，有显著的抗菌、抗炎和抗痉挛作用，芹菜素还可以抑制变形链球菌从而降低患龋齿的发生概率[29]。木樨草素与芹菜素类似，存在于蔬菜和水果中，可作为一种清除活性氧（ROS）的抗氧化剂和拥有自动氧化的能力而作为一种促氧化剂，木樨草素具有抗炎、抗癌、抗过敏等作用，可抑制化脓性链球菌[30]。

图5 黄酮类差异代谢物条形图Fig.5 Bar chart of flavonoid differential metabolites

一品红块根中低于俄罗斯红块根的黄酮类成分有12 种，大体为6 种葡萄糖苷、2 种木糖苷、异牡荆素、川陈皮素、甲氧基黄酮类衍生物、香叶木苷等。由图可看出俄罗斯红中有4 种葡萄糖苷和香叶木苷的含量高出一品红3 倍以上，其中差异倍数最大的成分是香叶木苷。香叶木苷是一种半合成药物，可用于治疗慢性静脉功能不全、静脉曲张等静脉疾病[31]，可推测出俄罗斯红在此方面的功效优于一品红。

2.4.3 不同品种红甜菜块根中其他类黄酮代谢产物分析

由图6 可知，两种红甜菜品种中有其他类黄酮成分10 种，这10 种其他类黄酮成分大体为二甲氧基类衍生物、蒽酮、杧果苷、二氢色原酮、异芒果苷、半乳糖苷等物质的衍生物。二甲氧基类化合物具有优良的抗肿瘤活性,侧链含有二甲氧基的化合物具有抗前列腺癌、抗肺癌、抗乳腺癌等功能[32]。根据成分差异分析表明一品红中二甲氧基类衍生物含量高出俄罗斯红3 倍以上，可推测一品红在上述功能方面较俄罗斯红更为突出。

图6 其他类黄酮代谢物条形图Fig.6 Bar chart of other flavonoid metabolites

2.4.4 不同品种红甜菜块根中黄酮醇代谢产物分析

两种红甜菜品种中有23 种黄酮醇成分，这23种黄酮醇成份大体为桑色素、杨梅素、山柰酚、槲皮素、鼠李素、异鼠李素、万寿菊素、柠檬素、柽柳苷等物质的衍生物。在黄酮醇差异倍数条形图中（见图7），差异倍数最大的是甲氧基槲皮素和异鼠李素糖苷。异鼠李素是一种天然类黄酮，具有广泛的药理活性[33]和健康益处，并且异鼠李素及其不同糖苷因其结构不同而具有不同的生物学效应[34]，包括抗肿瘤作用[35,36]、抑制脂肪生成[37]、保护心脑血管器官[38,39]、药用作用[40]等。在一品红中的异鼠李素-3-O-芸香糖苷-4,-O-葡萄糖苷含量相较于俄罗斯红大约高出10 倍以上，由此可推测一品红在上述方面较俄罗斯红效果更好。研究发现槲皮素可以清除自由基并且具有抑制氧化呼吸链的扩散，抗癌、抗肿瘤及降血脂等多重功效[41]。俄罗斯红中槲皮素含量则高出一品红10 倍以上，可推测出俄罗斯红在上述的功能和效果中比一品红更为突出。山柰酚能抑制大肠杆菌[42]。

图7 黄酮醇类差异代谢物条形图Fig.7 Bar chart of flavonol differential metabolites

槲皮素具有高抗氧化和抗炎活性，对牙龈卟啉单胞菌有显著的抑制作用[43]。杨梅素以游离和糖苷结合的形式天然存在，难溶于水，具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎症、抗血小板聚集、抗凋亡和肝保护活性[44]。由此可推测出两种红甜菜块根在抑菌、抗炎、抗氧化、抗癌和抗过敏等方面可能具有显著功效。

2.4.5 不同品种红甜菜块根中二氢黄酮和橙酮代谢产物分析

两种红甜菜的二氢黄酮类成分有新橙皮苷和橙皮苷两种,均为橙皮素糖苷化合物。橙皮素是从柑橘类水果中提取的一种天然化合物，其抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗癌和神经保护活性已被充分证实[45]。

在两种红甜菜品种当中，只含有一种橙酮成分为6-O-β-D-葡萄糖基海生菊，一品红红甜菜中橙酮俄罗斯红甜菜橙酮的差异倍数为（log2FC:2.35E-01）。橙酮在医用方面，具有抗癌[46,47]、抗真菌[48]、抗炎[49]、抗病毒[50]等重要作用。

2.5 差异代谢物KEGG pathway综合比对及特征代谢物分析

所有黄酮类物质主要富集于黄酮、黄酮醇和其他类黄酮合成的代谢通路中。将一品红和俄罗斯红已知的7种代谢物映射到两个代谢通路中（图8、9）。依据log2FC 差异倍数从高到低及代谢产物类型建议将柽柳苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷-4’-O-葡萄糖苷、山柰酚-4’-O-葡萄糖苷、6,7,8-三羟基-5-甲氧基黄酮、金圣草黄素、7-甲氧基-3-[1-(3-吡啶基)亚甲基]-4-二氢色原酮、异鼠李素-3-O-(2’’-O-葡萄糖基)半乳糖苷-7-O-葡萄糖苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷列为一品红（红甜菜）的特征性代谢物。5,2’-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮葡萄糖苷*、槲皮素-3-O-(6’’-O-乙酰)半乳糖苷、香叶木苷、香叶木素-7-O-葡萄糖苷*、香叶木素-7-O-半乳糖苷*、6-甲基山柰酚-3-O-葡萄糖苷*、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素-2’’-O-木糖苷、异牡荆素列为俄罗斯（红甜菜）的特征性代谢物。

图8 黄酮和黄酮醇生物合成途径Fig.8 Biosynthetic pathways of flavonoids and flavonols

图9 其他类黄酮生物合成途径Fig.9 Other flavonoid biosynthetic pathways

3 结论

两种甜菜块根共检测出类黄酮类代谢物69 个，分成黄酮、黄酮醇、查尔酮、二氢黄酮、橙酮类和其他类黄酮六种类型，其中黄酮类代谢物31 种，占44.93%；黄酮醇类代谢物有23 种，占33.33%；其他四种类型分别占比：2.90%、2.90%、1.45%和14.45%。差异代谢物29 种，在一品红（红甜菜）块根中12 种差异代谢物含量高于俄罗斯（红甜菜）块根，17 种差异代谢物含量低于俄罗斯红甜菜块根。根据代谢物log2FC 判定差异倍数较大的成分主要是五羟基查耳酮类、异鼠李素、二甲氧基黄酮、蒽酮、多甲氧基黄酮、槲皮素、山柰酚、香叶木素、高车前素等成分的衍生物。一品红（红甜菜）块根较俄罗斯（红甜菜）块根类黄酮类代谢产物相对含量高的成分是多甲氧基黄铜类衍生物、高车前苷、异鼠李素等。俄罗斯红较一品红块根类黄酮代谢产物相对含量较高的成分有：金圣草黄素、香叶木素、买麻滕乙素等。被注释到KEGG 通路上的代谢物有7 种：在黄酮和黄酮醇的生物合成途径上，分别为3-O-甲基槲皮素(3-O-Methylquercetin)、木犀草甙（Luteoloside）、3’-O-甲基木犀草素（3’-O-Methylluteolin），芦丁（Rutin）、异槲皮苷（Isoquercitrin）、异牡荆素（Isovitexin）、三叶豆甙（Trifolin）。目前国内对红甜菜的类黄酮类代谢产物研究较少。虽然甜菜块根中的类黄酮类化合物的代谢通路中含有这些物质，但是还没有具体的研究表明这些物质是否能更有效的和红甜菜一起运用到人们的餐桌食品和营养健康上，同时这对我们之后的研究也提供了一个新方向新思路。

通过分析发现2 种甜菜材料中存在具有明显差异的类黄酮类代谢物，建议可作为特征代谢物做进一步分析。