无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤抗氧化及部分免疫酶活性的影响

李卓 彭祖想 任同军 韩雨哲

摘 要：为探讨在无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤（Cyprinus carpio）抗氧化性能和免疫酶活性的影响，研究设计了5组等氮等脂的饲料，分别添加不同水平的限制性氨基酸（Met∶Lys=0.318），即0%（G1组）、05%（G2组）、1.0%（G3组）、1.5%（G4组）、2.0%（G5组）。选取初始体质量为（55.54±0.09）g的鲤150尾，进行了为期8周的养殖试验。研究结果显示，适量补充限制性氨基酸能够提高鲤的总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧物歧化酶（T-SOD）和過氧化氢酶（CAT）活性；同时降低丙二醛（MDA）含量。G4和G5组的T-AOC活性显著高于对照组（P＜0.05），G2、G3、G4和G5组的T-SOD和CAT活性显著高于对照组（P＜0.05），G5组的MDA含量显著低于G1、G2和G3组（P＜0.05）。随着限制性氨基酸补充水平的增加，鲤肝脏的ACP、AKP和LZM活性也呈上升趋势。G3、G4和G5组的ACP活性显著高于对照组（P＜0.05），G4和G5组的AKP和LZM活性显著高于对照组（P＜0.05）。根据试验结果，可以得出结论：在本试验条件下，适量补充限制性氨基酸能够增强鲤的抗氧化性能和部分免疫酶活性，其中2.0%的限制性氨基酸补充量效果最好。

关键词：无鱼粉；限制性氨基酸；鲤（Cyprinus carpio）；抗氧化；非特异性免疫

鱼粉是一种高质量的动物蛋白质来源，含有适宜的氨基酸组成，被广泛用于养殖水产动物。然而，近年来，鱼粉的供应不稳定且价格昂贵，限制了养殖业的可持续发展。因此，研究人员尝试在实际生产中使用其他动植物蛋白质源来替代鱼粉，开发无鱼粉的饲料配方。然而，一般的动植物蛋白质源缺乏一些必需的氨基酸。为了平衡饲料中氨基酸的组成，研究人员通过添加晶体氨基酸来获得理想的蛋白质来源[1-3]。鸡肠粉（CGM）是一种利用新鲜鸡肠加工而成的新型高质量饲料蛋白质源，其粗蛋白质和粗脂肪含量接近甚至高于鱼粉，但仍缺乏赖氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）等一些必需氨基酸[4-6]。因此，添加适量的赖氨酸和蛋氨酸来平衡鸡肠粉中的氨基酸组成，可以充分利用鸡肠粉并使其成为理想的蛋白质来源。

研究结果显示，当常规的动植物蛋白质原料高比例或完全替代鱼粉时，水产动物的抗氧化状态和免疫能力通常会下降[7-9]。这可能是因为动植物蛋白质原料中存在抗营养因子和（或）缺乏某些必需氨基酸。相关研究表明，适量添加赖氨酸和蛋氨酸可以提高水产动物的抗氧化能力和免疫力[10-12]。然而，目前还没有关于使用鸡肠粉作为动物蛋白质源开发无鱼粉饲料的相关报道。鲤（Cyprinus carpio）是中国重要的淡水经济养殖品种，在水产养殖中具有重要地位。根据《2021中国渔业统计年鉴》[13]的数据，2020年中国鲤养殖产量达到289.67万吨，较2019年增加了1.14万吨。因此，开发无鱼粉饲料对鲤养殖具有重要意义。本研究选择鲤作为研究对象，在不添加鱼粉的情况下，主要以鸡肠粉作为动物蛋白质源，并补充赖氨酸和蛋氨酸。旨在研究不同限制性氨基酸添加水平对鲤抗氧化能力和免疫酶活性的影响，为鸡肠粉在淡水鱼饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计和管理

试验使用的鲤鱼种购买自辽宁省丹东市当地养殖场，并在一个尺寸为4.3 m×1.5 m×1.2 m的水泥池中进行了为期2周的预养，以适应试验环境。在预养期间，投喂对照组饲料。鱼类养殖试验在大连海洋大学辽宁省北方鱼类生物学及增养殖重点实验室的循环水池（尺寸为4.3 m×3.0 m×1.4 m）中进行，并使用了网箱进行养殖。选取初始体质量为（55.54±0.2）g的鲤150尾，随机分为5组，每组有3个重复，每个重复中放置10尾鱼，共使用15个尺寸为1.3 m×0.8 m×07 m的聚乙烯网箱。养殖周期为8周，从2021年6月19日至8月14日，每日上午9：00和下午17：00各投喂一次，以保持鱼类饱食状态。每日清理底部一次，并进行一次水的置换，置换量约占总水量的1/5。试验使用的水源为经过曝气处理超过24 h的自来水。试验期间保持自然光照，水温维持在（27.0±1.0）℃，溶解氧浓度为（70±0.5）mg/L，pH值为（7.6±0.5）。

1.2 试验饲料及试验设计

鸡肠粉由辽宁省鞍山裕丰饲料有限公司提供，其粗蛋白含量为65.47%，粗脂肪含量为1480%。其他试验饲料原料均在大连当地市场购买。根据表1所示的饲料配方及其蛋氨酸和赖氨酸含量，以鸡肠粉和豆粕为主要蛋白源，以豆油为主要脂肪源，配制了5组等氮等脂的饲料，分别命名为G1、G2、G3、G4、G5。参考鲤的营养需求[14]和原料中蛋氨酸和赖氨酸的含量确定蛋氨酸与赖氨酸的比值为0.318，并相应添加了限制性氨基酸。各组限制性氨基酸（Met∶Lys=0318）的添加量分别为0%（G1组，对照组）、05%（G2组）、1.0%（G3组）、1.5%（G4组）和2.0%（G5组）。所有饲料原料经过60目筛网过滤，混合均匀后，使用制粒机制成2 mm大小的颗粒饲料。饲料在42 ℃烘箱中烘干至水分含量为10%，随后装入自封袋中，并储存在-20 ℃的冰箱中保存。

1.3 样品采集及指标测定

试验结束后，试验鱼禁食24 h，并使用50 mg/L的MS-222溶液麻醉。从每个网箱中随机选取5尾鱼，将其肝脏样品提取至冰盘中，并进行混合。混合后的样品装入管中，在-80 ℃保存待测。为了分析鲤肝脏的抗氧化指标和免疫酶活性，将肝脏样品按照样品质量与生理盐水体积1∶9的比例，在冰水浴中使用玻璃研磨器进行研磨。随后，将研磨后的样品注入离心管中，在4 ℃、3 500 r/min、10 min的高速离心下，取上清液进行后续测定。使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，测定了鲤肝脏的总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、肝脏酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和溶菌酶活性（LZM）。

1.4 数据处理

试验数据以平均值±标准误（Mean ± SE）的形式呈现，并使用GraphPad Prism软件进行图表绘制。使用IBM的SPSS 25.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并使用Duncan's方法进行多重比较，以分析各处理组之间的显著性差异。将P值小于0.05的结果视为具有显著差异。

2 结果

2.1 无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏抗氧化能力的影响

根据表3的结果显示，当无鱼粉饲料中添加限制性氨基酸后，鲤肝脏的总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性呈现上升趋势。具体来说，G4和G5组的T-AOC活性显著高于对照组（P＜005），而G2、G3、G4和G5组的T-SOD和CAT活性也显著高于对照组（P＜0.05）。同时，随着限制性氨基酸补充水平的增加，丙二醛（MDA）含量呈现下降趋势。此外，G5组的MDA含量显著低于G1、G2和G3组（P＜0.05）。综上所述，表3结果表明无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏的抗氧化能力产生影响。

表3 无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏抗氧化能力的影响

组别总抗氧化能力T-AOC/U·mg-1prot总超氧物歧化酶T-SOD/U·mg-1prot过氧化氢酶CAT/U·mg-1prot 丙二醛MDA/nmol·mg-1prot

G117.53±0.77a108.12±3.72a10.42±0.22a5.67±0.45c

G223.11±0.52ab135.52±1.61b11.89±0.19b4.90±0.36bc

G324.20±0.21ab136.82±1.00b12.18±0.21b4.18±0.37b

G436.28±3.94b172.32±4.79c14.30±0.12c3.86±0.07ab

G536.60±9.58b177.81±2.72c14.67±0.12c2.95±0.18a

注：同列中標有不同小写字母者表示组间有显著性差异（P<0.05），标有相同小写字母者表示组间无显著性差异（P>0.05）。

2.2 无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏免疫酶活性的影响

根据图1至图3的结果显示，无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（LZM）活性具有显著影响（P＜0.05）。随着限制性氨基酸补充水平的增加，鲤肝脏中的ACP、AKP和LZM活性呈现上升趋势。具体而言，G3、G4和G5组的ACP活性显著高于对照组（P＜0.05），而G4和G5组的AKP和LZM活性也显著高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏抗氧化能力的影响

水产动物具有抗氧化酶保护系统，包括T-SOD、CAT和GSH-Px等酶，可以清除过量的氧化自由基，减少脂质氧化引起的损害。脂质过氧化损伤的生物标志物是MDA，可以间接反映细胞的损伤程度[16]。相关研究已经表明，适量补充赖氨酸和蛋氨酸的饲料可以增强建鲤（Cyprinus carpio var. Jian）[17]、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[18]和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[19]等水产动物的抗氧化能力。另外，迟淑艳等[20]的研究显示，适量添加蛋氨酸的饲料可以增强斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝脏的SOD和CAT活性，提高其抗氧化能力。Ahmed等[21]的研究发现，适量添加赖氨酸的饲料可以增强虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中SOD和CAT的活性，降低MDA含量。此外，Huang等[18]认为适量添加赖氨酸的饲料可以调节草鱼的抗氧化酶相关基因表达，增强其抗氧化酶活性。本次试验的结果与前人的研究相一致，无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸后，鲤肝脏中的T-AOC、T-SOD和CAT活性呈上升趋势，MDA含量则呈下降趋势。这表明适量补充限制性氨基酸可以提高鲤肝脏的抗氧化能力，并降低MDA含量。具体而言，G5组的T-AOC、T-SOD和CAT活性显著高于其他组，MDA含量显著低于其他组，这表明2.0%限制性氨基酸补充量对于提高鲤肝脏的抗氧化能力有最佳效果。

3.2 无鱼粉饲料中补充限制性氨基酸对鲤肝脏免疫酶活性的影响

鱼类属于低等脊椎动物，非特异性免疫系统在机体防御中极其重要，免疫酶活性，如ACP、AKP和LZM等，可以反映出机体的免疫能力[22]。李小军[23]研究发现，适量添加蛋氨酸的饲料能够提高虎龙杂交斑（E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）血清中LZM活性和免疫球蛋白（lgM）浓度，刺激头肾中HSP70基因的表达，增强龙虎杂交斑的免疫能力。类似地，李雪吟[24]的研究显示，适量添加赖氨酸的饲料能够增强草鱼肠道中LZM和ACP的活性，上调Hepcidin和LEAP-2基因的表达，增强草鱼的免疫能力。在本试验中，随着限制性氨基酸补充水平的增加，鲤肝脏中的ACP、AKP和LZM活性呈上升趋势。G5组的ACP、AKP和LZM活性显著高于其他组，这表明无鱼粉饲料中适量添加限制性氨基酸可以提高鲤肝脏的免疫酶活性。Hu等[25]的研究指出，饲料中赖氨酸的缺乏会上调草鱼皮肤、脾脏和头肾中IL-1β促炎症因子基因的表达，从而引发炎症。Yang等[26]的研究也表明，赖氨酸可以作为一种营养物质降低大口黑鲈（Micropterus salmoides）促炎症因子mRNA的表达，从而减少炎症反应。另外，赖氨酸的补充还可以在一定程度上增强机体对氧化自由基的清除能力，降低炎症反应，这与本试验中抗氧化酶和免疫酶活性的结果相一致。基于以上研究和试验结果，可以得出结论，适量补充限制性氨基酸可以显著提高鲤的免疫酶活性，并将对鲤的免疫能力产生积极影响。

4 结论

在本试验条件下，适量补充限制性氨基酸到无鱼粉饲料中能够增强鲤肝脏的抗氧化能力和部分免疫酶活性，其中2.0%的补充量效果最佳。

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