全基因组测序在食源性沙门氏菌监测中的应用

汪忆梦 于明明

基金项目：潍坊市卫生计生委科研项目计划（WFWSJK-2021-143，WFWSJK-2022-236）。

作者简介：汪忆梦（1989—），女，山东东营人，硕士，主管技师。研究方向：食品微生物和病原微生物检验。

通信作者：于明明（1983—），女，山东潍坊人，硕士，副主任技师。研究方向：食品和病原微生物检验。E-mail： 20932641@qq.com。

摘 要：沙门氏菌是重要的食源性致病菌，给社会带来了严重的公共卫生和经济影响。随着高通量测序技术的发展，全基因组序列分析在沙门氏菌的监测中显示出了极大的发展潜力和价值。本文综述了全基因组序列分析在沙门氏菌血清型鉴定、分子分型以及耐药研究领域中的应用前景。利用高通量测序技术与沙门氏菌抗原相关基因数据库比对进行血清型的预测，在血清凝集方法难以确定血清型的情况下发挥重要作用。与传统的细菌分子分型方法相比，全基因组测序技术速度更快、分辨率更高，且易于实现实验室间比较，在公共卫生事件中可用于快速识别病原体并进行溯源分析。利用耐药基因数据库从基因水平上发现其携带的耐药基因，结合耐药表型进一步探索其耐药机制。随着高通量测序技术和生物信息技术的不断成熟，更多的共享数据库平台不断出现，全基因组序列分析将应用于更广泛的领域。

关键词：全基因组测序；食源性沙门氏菌；血清分型；分子分型；抗生素耐药

Application of Whole Genome Sequencing for the Monitoring Foodborne Salmonella

WANG Yimeng， YU Mingming*

（Weifang Disease Control and Prevention Center Microbiology Laboratory， Weifang 261061， China）

Abstract： Salmonella is an important food-borne pathogen that is associated with serious public health and economic implications. With the development of high-throughput sequencing technology， Whole genome sequencing has shown great potential and value in the surveillance of Salmonella. The review strives to discuss the serotype identification， molecular typing and antimicrobial resistance profiles of Salmonella in Whole genome sequence and looks forward to its future. The prediction of serotypes using high-throughput sequencing technology compared with Salmonella antigen-related gene databases plays an important role in cases where serotypes are difficult to determine by serum agglutination methods. Whole genome sequencing technology is faster， higher resolution， and easy to achieve inter-laboratory comparisons than traditional bacterial molecular typing methods， and can be used for rapid identification of pathogens and traceability analysis in public health events. The drug resistance gene database is utilized to discover the drug resistance genes they carry at the gene level， and to explore their resistance mechanisms in conjunction with the drug resistance phenotype. With the continuing maturation of high-throughput sequencing and bioinformatics approaches， and the emergence of more shared database platforms， whole genome sequence analysis will be applied to a wider range of fields.

Keywords： whole genome sequence analysis; food-borne Salmonella; serotype; molecular typing; antimicrobial resistance

沙門氏菌是目前公共卫生学公认的人畜共患食源性致病菌，感染力强，血清型复杂[1]，目前已发现2 600多种血清型，其中伤寒、副伤寒沙门氏菌专性感染人类，可引起我国法定传染病伤寒、副伤寒[2]，其他血清型宿主广泛，可寄生在禽类和畜类等肉产品来源的养殖动物体内，也可感染人类，引起以发热、腹痛、腹泻等症状为主的急性肠胃炎、败血症以及其他并发症[3]，每年全球有超过1亿例腹泻病与沙门氏菌感染有关，医疗负担严重[4]。沙门氏菌腹泻病与食用了被该菌污染的食物密切相关，世界各地每年都有大量沙门氏菌引起的食物中毒和感染的相关报道[5-6]，在我国，70%～80%的细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起的[7]。世界卫生组织将沙门氏菌列为具有中等危害和严重危害的食源性致病菌，是世界各国重点监控的食源性致病菌[8]。

传统的沙门氏菌检测方法是利用沙门氏菌对胆盐、煌绿耐受的特点，将食品或者临床样本进行选择性增菌后，在选择性平板上划线分离沙门氏菌，然后利用沙门氏菌的生化特点进行鉴定，该方法需要5～7 d

可分离得到沙门氏菌菌株。随着飞行质谱、核酸检测等新技术的应用，分离周期可缩短为3～5 d。

平板划线法成本低、用时长，可用于风险监测、菌株收集、常规食品等样本检测，也是公共卫生事件中得到菌株证据必不可少的手段，但需要借助其他方法对沙门氏菌进行分型、溯源、耐药等进一步的分析。随着高通量测序技术的发展，将病原菌整个基因组的核苷酸序列进行解读，获得更多的遗传信息变为可能，在细菌病原学和流行病学研究中得到了越来越广泛的应用[9]。本文将讨论高通量测序技术及全基因序列分析在沙门氏菌监测和流行病学调查中的原理和应用，以及遇到的问题和挑战。

1 全基因序列分析在沙门氏菌血清分型中的应用

20世纪，沙门氏菌血清分型沿用了世界卫生组织国际沙门菌协作和研究中心公布的怀特-考夫

曼-勒密诺表（White-Kauffmann-Le Minor Scheme，WKLM），是基于沙门氏菌的表面蛋白、荚膜和鞭毛等抗原与特异血清的凝集的分型方法，目前仍是沙门菌血清分型的金标准，该系统将沙门氏菌分为46个

血清群，2 659个血清型，不同血清型对人类和动物的致病性有所差异[10]。由于沙门氏菌存在自身抗原变异现象，以及抗原表达量的高低、操作人员的技术水平、主观判断都会影响血清凝集结果的准确性，此外商业化血清种类和质量的局限性，也导致了少数无法凝集确定血清型的现象。如果通过高通量测序和拼接获得沙门氏菌全基因组序列，便可与已知的沙门氏菌血清型相关抗原序列比对，预测沙门氏菌血清型。随着生物信息学的飞速发展，ZHANG等[11]公布了沙门菌抗原相关基因序列信息并建立了SeqSero数据库平台，目前已更新至2.0版本；YOSHIDA等[12]于2016年建立了SISTR（Salmonella in Silico Typing Resource）数据库平台；中国疾控中心传染病所在已有平台的基础上开发优化了沙门菌血清型预测软件SalmonSeroPredicition，用户均可提交自己的沙门氏菌基因组序列到平台预测血清型[13]。此外，检索沙门氏菌基因组序列中的管家基因并在MLST数据库中进行比对，也可进行沙门氏菌血清型预测，但由于该方法只比对了7个管家基因，且数据库中ST型和血清型种类尚未完善，其精准程度低于全基因组SNP系统发育分析，但运行速度快，占用计算机资源少，可作为辅助手段[14]。陈丹妮等[15]将包含50种血清型的509株沙门氏菌分别用SISTR、MLS、SalmonSeroPredicition3个平台和传统的血清凝集方法进行结果比对，得到三者的准确率分别为96.67%、93.52%、69.16%；张璐等[16]比较了283株沙门氏菌，分别用SeqSero2.0和传统血清凝集方法得到的血清型结果，符合率为97.6%，同ZHANG等[11]公布的98.7%相近。基于全基因组序列的沙门氏菌血清分型具有较高的应用价值，随着数据库和生物信息学手段的完善，将得到更广泛的应用。

2 全基因序列分析在沙门氏菌分子分型和疾病暴发事件中的应用

传统的细菌分子分型技术包括脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）、多位点序列分型（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）、多位点可变数串联重复分析（Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis，MLVA）等，曾是致病菌监测、识别和溯源的标准方法，目前仍是我国国家致病菌识别网Pulsenet和食源性疾病分子溯源网络的主要工具。这些技术对高克隆化的菌株分辨力有限，以肠炎沙门氏菌为例，85%的肠炎沙门可以归为5个PFGE型别，难以精准分型，且操作过程烦琐，检测通量低[17]；常规AFLP、RFLP、MLST仅对细菌基因组中的一小部分序列进行分析，在疫情暴发监测中逐渐被基于全基因组的单核苷酸多态性分型（wgSNP）和基于全基因组的多位点序列分型（wgMLST）所取代。BAKKER等[18]在一起沙门氏菌疾病暴发事件中，将PFGE图谱完全相同的沙门氏菌分离株，改用wgSNP分析，准确识别了暴发前后的菌株，并检测到以往小型暴发；巴伐利亚州食品安全局利用全基因组测序分析技术，追溯了2017—2021年牛群间疫情暴发的原因，发现该事件由山区牧场来源的沙门菌引起[19]。wgMLST可对病原菌基因组上千个基因位点进行分析分型，具有比常规MLST更高的分型能力，可以区分常规MLST型别和PFGE带型完全一致而在流行病学上不相关的菌株。与wgSNP相比，wgMLST对生物信息分析的要求较低，具有快速、标准化、高分辨的特点[20]。

3 全基因序列分析在沙门氏菌耐药研究中的应用

患病的人和动物以及携带者都是沙门氏菌传染源，抗生素是治疗沙门氏菌病的首选药物。但在畜牧产业中抗生素常被作为促生剂滥用，以及临床治疗上不规范使用抗生素，均造成了沙门氏菌的耐药性。沙门氏菌在抗生素选择的压力下，可通过以下途径产生耐药性。①产生灭活酶、钝化酶或修饰酶，或作用于抗生素使之失活，或修饰结合位点使药物无法作用，如超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶的产生，导致对β-内酰胺药物的耐药性[21]；乙酰转移酶、腺苷转移酶、磷酸转移酶等修饰氨基糖苷类药物使之钝化[22]。②基因突变或缺失导致药物的作用靶点的改变，使药物不能透过细胞膜，或不能与作用靶点结合。如GyrA、GyrB基因变异导致沙门氏菌对喹诺酮类药物敏感性降低[23]。③从整体上改变细胞膜通透性、主动外排機制、可移动的耐药遗传元件等，可使沙门氏菌产生多重耐药[24]。随着研究的进步，将有更多的耐药机制被发现，同时沙门氏菌的耐药也是动态变化的，对其监测具有重要意义。常规药敏试验采用的是美国临床实验室标准化委员会推荐的肉汤稀释法，是经过细菌培养后基于表型的药敏方法，在基因水平上，常用PCR方法检测耐药基因，受限于已知的耐药基因，而通过全基因组序列分析进行耐药分析，通量大、耗时少、准确度高，可从基因组范围检索更多耐药基因，在分子水平上探索耐药机制，结合表型实验，研究耐药基因的表达和调控水平。目前最常用的耐药数据库为ResFinder和抗生素抗性基因数据库，张璐等[16]、畅晓辉等[25]分别对药敏实验结果与全基因组序列分析耐药结果进行比对，发现耐药基因的预测与表型基本一致，其差异之处正是需要进一步研究的契机。

4 結语

食源性沙门氏菌的监测是重要的公共卫生组成部分，也是食品风险监测、食源性疾病监测的重要内容，将全基因组序列分析应用于该领域，发挥其在暴发和溯源分析、流行病学的调查中的领先作用具有重要意义。随着高通量测序技术的不断发展，生物信息技术的不断成熟，研究软件的不断更新迭代，全基因组序列分析将成为研究沙门氏菌分型、致病和耐药机制等领域的常规必备手段。随着测序技术的发展，其检测成本不断降低，全基因组测序将应用于更广泛的领域。

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