UPLC 指纹图谱结合多指标成分的广东王不留行质量评价研究

钟春琳，沈柳宏，罗宇琴，潘礼业，宋叶，李国卫，兰小勇，陈向东

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528000

广东王不留行别名薜荔果、木莲、鬼馒头、凉粉果等，为桑科植物薜荔Ficus pumilaL.的干燥隐头花序托，具有祛风利湿、活血解毒功效，用于风湿痹痛、泄痢、淋病、跌打损伤、痈肿疮疖。广东王不留行在秋季采收，摘取近成熟的隐头花序，稍烫，纵切成2～4 瓣，除去瘦果，晒干[1]。广东王不留行主产于广东、广西，在浙江、江苏、四川等地也有分布[2]，化学成分主要包括三萜类、黄酮及其苷类、甾体、倍半萜、香豆素[3-4]。广东王不留行中绿原酸和芦丁同时测定的研究已有报道[5-7]，但单指标含量往往无法全面反映药材质量优劣。近年来，通过建立特征指纹图谱进行研究为中药材质量评价体系建立的常见手段[8-10]。熵权法是以评价对象指标数据的变异幅度为依据确定权重值的客观赋权法，其基于差异驱动原理，着重突出指标间的局部差异，直接利用决策矩阵对所给出的评价指标计算权重，熵权法不引入决策者的主观判断，可避免主观因素对结果的影响[11]。灰度关联分析是多种因素统计分析的一类方法，是以各因素的样品数据为依据，用灰度关联法来衡量各因素间关联性大小[12]。因此，本研究建立广东王不留行药材特征图谱，并测定不同产地广东王不留行药材中绿原酸和芦丁，采用熵权法和灰度关联法建立质量评价模型，以期为广东王不留行的质量控制和评价提供参考。

1 仪器与材料

Thermo Vanqiush 型高效液相色谱仪（赛默飞公司），ME204E 万分之一天平（梅特勒-托利多公司），XP26 百万分之一天平（梅特勒-托利多公司），KQ500DE 数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），HWS28 型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），Mili-Q Direct 超纯水系统（默克股份有限公司）。乙腈、甲酸、磷酸为色谱纯，其他试剂分析纯；水为超纯水。

绿原酸（批号 110753-202018，质量分数96.1%）、芦丁（批号100080-202012，质量分数92.2%）对照品均由中国食品药品检定研究院提供；新绿原酸对照品（批号wkq18030107，质量分数98.0%）由维克奇生物科技有限公司提供；隐绿原酸对照品（批号DST210427-035，质量分数98.24%）由成都乐美天医药科技有限公司提供。

收集的13 批不同来源的广东王不留行药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为桑科植物薜荔Ficus pumilaL.的干燥隐头花序托。样品信息见表1。

表1 样品信息表Table 1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 UPLC 特征图谱的建立

2.1.1 对照品溶液的配制 取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成各含50 μg/mL 的混合溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取广东王不留行药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 Waters HSS T3 柱（100 mm×2.1mm，1.8 μm）；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，4%→6% A；5～10 min，6% A；10～14 min，6%→11% A；14～16 min，11%→18% A；16～22 min，18% A；22～26 min，18%→75% A；26～30 min，75%→95% A）；检测波长为300 nm；体积流量0.3 mL/min；进样量为1 μL；柱温为30 ℃。

2.1.4 精密度试验 取同一份广东王不留行供试品溶液（编号G1），连续进样6 次，以7 号峰绿原酸为参照峰，分别计算得8 个共有峰的相对保留时间RSD 值为0.05%～0.54%，相对峰面积RSD 值为0.50%～2.85%。

2.1.5 重复性试验 取同一批广东王不留行药材（编号G1），平行制备6 份供试品溶液，分别进样，以7 号峰绿原酸为参照峰，分别计算得8 个共有峰的相对保留时间RSD 值为0.03%～0.72%，相对峰面积RSD 值为0.16%～1.90%。

2.1.6 稳定性试验 取同一份广东王不留行供试品溶液（编号G1），分别在室温下放置0、2、5、7、9、12 h 进行测定，以7 号峰绿原酸为参照峰，分别计算得8 个共有峰的相对保留时间RSD 值为0.04%～0.87%，相对峰面积RSD 值为0.26%～3.98%，表明样品在室温放置12 h 稳定。

2.1.7 共有峰的标定 取13 批广东王不留行样品，制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。将所得色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会，2012.0 版）进行分析，确定8 个共有峰，见图1。

图1 广东王不留行药材的UPLC 特征图谱Fig.1 UPLC characteristic chromatograms of Fici Pumilae Receptaculum

根据对照品指认，确定了广东王不留行特征图谱中峰4、7、8 分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸。见图2。

图2 混合对照品（A）和广东王不留行（B）UPLC 图谱Fig.2 UPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and Fici Pumilae Receptaculum (B)

2.1.8 相似度评价 采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0 版本）分别对G1～G13 共13 批广东王不留行药材样品UPLC 特征图谱进行数据处理，采用平均数，时间窗口为0.1，自动匹配，以广东王不留行共有模式作为对照特征图谱，计算相似度系数。13 批药材相似度均在0.98 以上，表明同一药材不同批次间的化学成分组成基本一致，结果见表2。

表2 广东王不留行药材的相似度Table 2 Similarity data of Fici Pumilae Receptaculum

2.2 绿原酸、芦丁的HPLC 法测定

2.2.1 对照品溶液的配制 取绿原酸、芦丁对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成含绿原酸50 μg/mL、芦丁10 μg/mL 的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取广东王不留行药材粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇为流动相A，1%醋酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～16 min，32% A；16～18 min，32%→40% A；18～20 min，40%→45%A；20～35 min，45% A）；检测波长为340 nm；进样量为10 μL；体积流量0.8 mL/min；柱温为25 ℃。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取含绿原酸1 269.5 μg/mL、芦丁292.79 μg/mL 的混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置5 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，进样分析。以待测成分质量浓度与峰面积拟合标准曲线，得到绿原酸标准曲线方程Y＝25 155X－19 875，r＝0.999 7；芦丁标准曲线方程Y＝15 541X－4 935.5，r＝0.999 9，绿原酸、芦丁分别在25.39～253.90、5.86～58.56 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取同一混合对照品溶液，连续进样6 次，测定峰面积，结果绿原酸、芦丁峰面积RSD 值分别为0.58%、0.54%。

2.2.6 重复性试验 取同一批广东王不留行样品（编号G1），平行制备6 份供试品溶液，进样分析，结果绿原酸、芦丁峰面积的RSD 值分别为0.70%、0.46%。

2.2.7 稳定性试验 取同一广东王不留行供试品溶液（编号G1），室温放置0、2、4、8、12、24 h测定，结果绿原酸、芦丁峰面积RSD 值为1.44%、0.80%，表明供试品溶液室温放置24 h 稳定。

2.2.8 回收率试验 分别称取绿原酸、芦丁对照品22.480、3.581 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇溶液制成含绿原酸2.16 mg/mL、芦丁0.33 mg/mL的加样回收母液。精密吸取上述母液1 mL 于具塞锥形瓶中，平行操作6 份，挥干溶剂。分别取广东王不留行药材（编号G1）粉末约0.5 g 置于上述6个锥形瓶中，精密称定，制备供试品溶液，进样分析，计算回收率，结果绿原酸、芦丁的平均加样回收率分别为103.03%、107.71%，RSD 值分别为1.15%、1.40%。

2.2.9 测定结果 分别取13 批不同产地广东王不留行药材粉末约1 g，精密称定，制备供试品溶液，进样测定，色谱图见图3，记录峰面积，按标准曲线法计算样品中绿原酸和芦丁的质量分数，结果见表3。

图3 混合对照品（A）和广东王不留行（B）HPLC 图谱Fig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and Fici Pumilae Receptaculum (B)

表3 广东王不留行中绿原酸、芦丁的测定结果（n＝2）Table 3 Determination of chlorogenic acid and rutin in Fici Pumilae Receptaculum (n＝2)

2.3 熵权法计算权重ρ 值

基于13 批广东王不留行药材特征图谱8 个特征峰峰面积、绿原酸和芦丁质量分数为评价指标，组成单元序列{Xij}（i＝1、2、3……m；j＝1、2、3……n；本研究中m=13，n=10）。由于各指标间量纲不统一，故对原始数据按公式Yij＝[Xij－minXij]/[maxXiminXi]（Yij为标准化处理后的数据，Xij为第i个样品第j个指标值）进行标准化处理。根据信息论中信息熵的定义，计算各个指标的信息熵为E1、E2、E3……Ej，计算各指标权重Wi＝（1－Ei）/（j－ΣEi），结果见表4。

表4 熵权法计算的广东王不留行指标信息熵和权重Table 4 Information entropy and weight of Fici Pumilae Receptaculum index calculated by entropy weight method

2.4 灰色关联度法计算各指标的相关关联度

2.4.1 无量纲化处理 在灰色关联度分析中，首先确定评价单元序列，设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列{Xij}（i＝1、2、3……m；j＝1、2、3……n；本研究中m＝13，n=10）。在多指标评价中因各指标单位、量级不同，无法进行直接评价，故需对原始数据进行无量纲化处理，计算公式为Yij＝Xij/Xj（Yij为处理后的数据，Xij为原始数据，Xj为样品第j个指标的平均值）。

2.4.2 关联系数的计算 选择参考序列，包括最优参考序列（所有样品中每一项指标最大值）和最差参考序列（所有样品中每一项指标最小值），分别记为{Ysj}、{Ytj}。相对与最优参考序列的关联系数计算公式为，其 中Δmin=min|Yij-Ysj|，Δmax=max|Yij-Ysj|；相对于最差参考序列的关联系数计算公式为，其 中Δ′min=min|Yij-Ytj|，Δ′max=max|Yij-Ytj|。本实验各指标权重Wi，即各指标的权重ρ 值，见表4。

2.4.3 关联度即相关关联度的计算 相对于最优参考序列的关联度r(s)，见表5；最差参考序列的关联度r(t)=，见表6。最佳评价单元是相对于最优参考序列的关联度r(s)最大，而相对于最差参考序列的关联度r(t)最小[13]。因此将评价单元序列同时相对于最优参考序列和最差参考序列的相对关联度ri=。根据相对关联度ri的大小对评价单元序列进行排序，并结合熵权法结果，优化得到优劣评价结果，见表7。

表5 广东王不留行各评价指标相对于最优参考序列的关联度Table 5 Correlation degree between evaluation indicators of Fici Pumilae Receptaculum and the optimal reference sequence

表6 广东王不留行各评价指标相对于最差参考序列的关联度Table 6 Correlation between various evaluation indicators of Fici Pumilae Receptaculum and worst reference sequence

表7 广东王不留行的相对关联度排序Table 7 Relative correlation ranking of Fici Pumilae Receptaculum

3 讨论

在广东王不留行特征图谱方法建立过程中，实验比较流动相不同梯度条件，选择多个检测波长（254、300、325 nm），用不同的磷酸浓度流动相系统（甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸）进行分析，结果表明检测波长为300 nm、流动相为甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱系统时，各特征峰响应强、分离度最优。实验还考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇的提取效果以及超声提取、回流的提取效果。以特征峰总峰面积、样品质量浓度为指标进行比较，结果使用50%甲醇超声提取40 min，各特征峰提取效果最佳。建立了UPLC 特征图谱方法，并指认了其中的3 个成分，分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸。

现代药理研究发现广东王不留行具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫的作用[14]。绿原酸和芦丁在抗菌抗炎、抗肿瘤、抗氧化等方面显示出较好的药理作用[15-17]。本研究测定了广东王不留行中绿原酸和芦丁，13 批药材中来源广东茂名的G5、G8 和来源广西南宁的G10 不符合《广东省中药材标准》第三版规定广东王不留行药材中绿原酸和芦丁总量不得少于0.35%，其他批次含量均符合规定。由于新绿原酸、异绿原酸含量较低，在本方法中响应低，与绿原酸和芦丁含量差异较大，不宜采用同法测定，故本研究仅测定绿原酸和芦丁。

为进一步比较不同产地广东王不留行药材中成分差异，本研究依据熵权法对指标ρ 值分别客观赋值，广东王不留行中峰4（新绿原酸）权重最大，说明其对广东王不留行的质量影响最大，其次是峰8（隐绿原酸）和芦丁，后续研究中建议把新绿原酸和隐绿原酸纳入研究。各评价指标对质量的影响根据熵权法赋值进行区分后，建立以特征图谱8 个特征峰峰面积、绿原酸和芦丁质量分数为指标的灰色关联度质量评价模型，将得到的数据通过相对关联度进行综合排序，广东王不留行的相对关联度为0.116 2～0.810 5，说明各产地的广东王不留行的质量存在一定的差异。根据相对关联度排序结果，广东肇庆产的广东王不留行质量最佳，因此该方法可用于评价广东王不留行药材质量。

本研究建立广东王不留行特征图谱，并以特征图谱峰面积、绿原酸和芦丁质量分数建立质量评价模型，可为广东王不留行药材品质评价标准研究提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突