甜瓜酸奶发酵工艺优化及其品质分析

曹燕飞，郝 鑫，李宏军，马成业，周陆红

（1.潍坊工程职业学院 农林科技学院，山东 青州 262500；2.山东理工大学 农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049；3.潍坊市农业科学院，山东 潍坊 261071）

甜瓜（Cucumis melo.L），属于葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis），是世界上第五大产量水果[1]。我国甜瓜种植面积和产量均位于世界首位，其品种资源有300多种[2]。青州银瓜属薄皮甜瓜种，产于山东青州市弥河沙滩，富含糖类、维生素、矿物质、酚类化合物等多种营养成分，有“瓜中佳品”的美称[3-4]。

酸奶是以鲜牛乳或乳粉为原料，经益生菌发酵而形成的乳制品，富含高生物价值蛋白质、矿物质、维生素以及必需脂肪酸等[5]。因其营养价值丰富、酸甜可口、柔滑细腻，具有预防骨质疏松症、缓解乳糖不耐症、降低胆固醇，同时促进肠道健康和提高免疫系统等多种功能，深受消费者欢迎[5-7]，特别是，在酸奶中添加水果已在工业上越来越受欢迎[8]。目前已有多种果蔬酸奶相继研发。PACHEKREPAPOL U等[9]研究发现，木薯淀粉的添加能改善椰子酸奶产品的物理化学和流变性质。周琪等[10]开发以刺梨为原料的抗氧化功能酸奶。蔡翔等[11]研究桑葚酸奶在贮藏过程中抗氧化活性和活性成分的变化，表明其在贮藏期（1～10 d）内抗氧化活性能力以及活性成分物质稳定性好。俸嫣莎[12]研究表明，猕猴桃苹果酸奶的最优配方工艺为混合果浆量30%、白砂糖用量8%、苹果与猕猴桃的果浆用量比1∶2、发酵温度42 ℃。但目前未见甜瓜酸奶品质特性的研究报道。

本研究以纯牛奶和甜瓜汁为原料制备甜瓜酸奶，以酸度、持水力和感官评分为考察指标，在单因素试验的基础上，采用响应面法对甜瓜酸奶的发酵工艺条件进行优化，并对甜瓜酸奶的贮藏特性、抗氧化活性、流变特性、微观结构和挥发性风味成分进行分析，以期为甜瓜酸奶产品的开发提供理论依据，为甜瓜深加工提供新思路，推动甜瓜产业的高质量发展，丰富酸奶市场的种类。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜瓜：青州市弥河银瓜种植基地；纯牛奶（每100 g含蛋白质3.0 g）：内蒙古伊利实业集团有限公司；乳酸菌酸奶发酵剂：北京川秀科技有限公司；赤藓糖醇：南京甘汁园糖业有限公司；氢氧化钠、无水乙醇：天津市致远化学试剂有限公司；罗丹明B：上海源叶生物科技有限公司；所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Y88多功能高端破壁机：九阳股份有限公司；JC-100-SE恒温培养箱：青岛精诚仪器仪表有限公司；J300-SH高速均质机：无锡雷磁仪器仪表有限公司；LC-FA2004电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TG1650-WS台式高速离心机：济南博坤科学仪器有限公司；PHS-3E型pH计：浙江纳德科学仪器有限公司；TU-1810 紫外可见分光光度计：江苏福曼斯仪器有限公司；Kinexus Lab旋转流变仪：英国Marlvern仪器公司；Olympus FV3000激光共聚焦显微镜：日本olympus有限公司；Clarus SQ8气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪、HP-5柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国PerkinElmer有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜酸奶的加工工艺流程及操作要点

甜瓜汁的制备：挑选成熟饱满、无虫害病害的甜瓜，将甜瓜洗净、去皮切蒂切半、去籽并取出果肉进行打浆处理，用纱布过滤除渣得到甜瓜汁，备用。

调配：将甜瓜汁以5%添加量（以纯牛奶质量为基准）添加到纯牛奶中，搅拌混匀后，添加7%的赤藓糖醇（以甜瓜汁加纯牛奶质量为基准，下同），进行均质处理；

杀菌：均质后将混合液在95 ℃下杀菌5 min；

接种、发酵：将混合汁冷却至42 ℃，加入接种量0.3%的酸奶发酵剂，放入42 ℃的培养箱内发酵7 h，直至乳液凝固[5]；

后熟：完成发酵后，迅速冷却至10 ℃以下，并置于4 ℃后熟24 h，得到甜瓜酸奶成品。

1.3.2 甜瓜酸奶发酵条件优化

单因素试验：以酸度、持水力和感官评分为指标，分别考察甜瓜汁添加量（0、5%、10%、15%、20%）、赤藓糖醇添加量（3%、5%、7%、9%、11%）、发酵时间（3 h、5 h、7 h、9 h、11 h）、接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对甜瓜酸奶品质的影响。

响应面试验：根据单因素试验的结果，以酸奶的感官评分（Y）作为响应值，以甜瓜汁添加量（A）、赤藓糖醇添加量（B）、发酵时间（C）、接种量（D）作为自变量，采用Box-Behnken试验设计对甜瓜酸奶的发酵条件进行优化，发酵条件优化响应面试验因素与水平见表1。

表1 发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization

1.3.3 甜瓜酸奶的贮藏品质分析

在最佳工艺条件下制备甜瓜酸奶，以不含有甜瓜汁的酸奶为对照，在0～4 ℃条件下贮藏21 d，分别于0、7 d、14 d、21 d取样，测定酸奶酸度、持水力、感官评分。

1.3.4 测定方法

（1）甜瓜酸奶的感官评价

参考王紫琳等[6]的方法，稍作修改。选取10名具有一定经验的专业相关人员，从色泽、气味、口感、组织状态4个方面对酸奶进行感官评价，满分100分。酸奶感官评分标准见表2。

表2 甜瓜酸奶感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of melon yogurt

（2）理化指标的测定

酸度的测定：参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中的直接滴定法；持水力的测定：参照WANG J等[13]的方法。

（3）共聚焦激光扫描显微镜分析

将5 mL酸奶样品与20 μL 0.2%的罗丹明B水溶液充分混合。将染色的样品在4 ℃下储存1 h后，转移到共聚焦激光扫描显微镜下观察样品的微观结构。

（4）流变学特性

参照PACHEKREPAPOL U等[9]的试验方法，使用动态振荡流变仪对酸奶进行流变学分析，采用具有1 mm间隙的铝板夹（40 mm直径）进行测量。酸奶样品在在4 ℃条件下以0.5%的应变进行频率扫描测试（0.1～10 Hz），并记录储能模量（G'）以及损耗模量（G"）的结果。

（5）挥发性风味物质分析

采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）结合气质联用（GC-MS）分析技术对酸奶的挥发性风味物质进行分析。将5 g酸奶样品置于20 mL顶空样品瓶中并在45 ℃水浴中平衡15 min，然后将老化的萃取头放入瓶中并将其暴露于样品上方的顶部空间来提取挥发性化合物。

GC条件：HP-5柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯度氦气（He），进样口温度250 ℃；恒定流速为1.0 mL/min；升温程序为初始温度60 ℃，以5 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min。采用不分流模式。

MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，采集方式为全扫描。

定性定量分析：挥发性物质通过计算机检索中（national institute of standards and technology，NIST）11谱库进行匹配，并将保留指数（retention index，RI）与GC×GC数据库的保留指数进行比较，采用正构烷烃同系物对保留指数进行校正，人工辅助解析图谱，鉴定出相似度＞80%的化合物[14]；根据峰面积归一化法计算挥发性成分的相对含量。

1.3.5 数据处理

所有试验均重复3次，采用Origin9.1、Design-Expert 8.0.6及SPSS23.0软件进行绘图、统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 甜瓜汁添加量的确定

酸奶酸度主要源于乳酸菌将发酵基质中的葡萄糖、果糖、乳糖等物质发酵分解产生乳酸，使酸奶pH值下降，酸度升高[15]。较高的酸度有助于抑制酸奶有害细菌的生长，延缓产品的变质[16]。甜瓜汁添加量对酸奶品质的影响见表3。

表3 甜瓜汁添加量对酸奶品质的影响Table 3 Effect of melon juice addition on yogurt quality

由表3可知，随着甜瓜汁添加量在0～20%范围内的增加，酸奶的酸度从76.95°T上升至85.27°T，这可能由于甜瓜汁中的低聚糖等成分可作为发酵基质，促进乳酸菌产酸，导致酸奶的酸度增加。另外，研究表明，果蔬中营养活性物质具有益菌效果[17-19]，甜瓜汁含有丰富的维生素C、酚类化合物等生物活性物质，促进乳酸菌活力，加速酸奶中有机酸的积累，提高酸度。

持水力能反映酸奶凝胶特性，其与酸奶凝胶网络结构的稳定性有关[20]。当甜瓜汁添加量为0～5%时，酸奶的持水力逐渐增加；当甜瓜汁添加量为5%时，持水力达80.20%，可能由于适量的甜瓜汁中可溶性多糖充当增稠剂，能增强蛋白质凝胶网络的致密性，改善酸奶的持水能力[21]。酸奶的持水力与蛋白质含量有关，酸奶中所含较低的蛋白质会导致在凝乳过程中形成的网状结构稀松使得持水能力下降[22]；当甜瓜汁添加量＞5%时，酸奶的持水力明显降低，这可能由于酸奶中蛋白质浓度较低导致。

当甜瓜汁添加量为0～5%时，酸奶的感官评分先增加；当甜瓜汁添加量为5%时，感官评分达到了最大值，为83.50分，此时酸奶中有适宜的甜瓜香味，口感柔滑；当甜瓜汁添加量＞5%时，甜瓜气味过浓、掩盖酸奶原有香气，组织粗糙，且因乳清析出较多而出现分层现象。因此，确定最适甜瓜汁添加量为5%。

2.1.2 赤藓糖醇添加量的确定

由表4可知，随着赤藓糖醇添加量的增加，酸奶的酸度逐渐降低。YAO J等[23]研究表明，赤藓糖醇对嗜酸乳杆菌在配方奶中产酸和增殖有抑制作用，赤藓糖醇的添加可能会抑制乳酸菌在发酵过程中产酸能力，从而导致酸度下降。随赤藓糖醇添加量在3%～11%范围内的增加，持水力从64.18%升高至86.52%，这是由于赤藓糖醇具有改善蛋白质的部分功能特性，可以稳定和保护生物大分子，抑制大分子聚集体形成，提高蛋白乳化液在不同环境因素条件下的稳定性[24]。随着赤藓糖醇添加量在3%～7%范围内的增加，酸奶的感官评分呈增加趋势，当赤藓糖醇添加量为7%时，感官评分最高，为85.0分，其口感和风味最佳；而赤藓糖醇添加量＞7%时，感官评分下降。因此，确定最适赤藓糖醇添加量为7%。

表4 赤藓糖醇添加量对甜瓜酸奶品质的影响Table 4 Effect of erythritol addition on melon yogurt quality

2.1.3 发酵时间的确定

由表5可知，发酵时间为3～11 h时，甜瓜酸奶的酸度逐渐增加。发酵时间为3～7 h时，持水力及感官评分随之增加；发酵时间延长至7 h，持水力和感官评分最高，分别为81.33%和84.10分，此时，酸度为82.83°T，此时甜瓜酸奶凝固好、组织均匀细腻、酸甜适中、风味协调，由于糖类转化为乳酸量逐渐增多，使酸奶基质中酪蛋白胶粒的稳定性下降，而且乳酸的存在会使酸奶基质的pH下降，当pH达到酪蛋白等电点（4.6）时，酪蛋白凝集发生交联沉淀，促进蛋白质的凝固，使得持水力增加，改善酸奶的组织状态[25]；当发酵时间＞7 h时，持水力及感官评分下降，酸奶出现口感偏酸，组织状态变差，且乳清析出严重的现象，可能由于酸奶发酵时间过度，导致发酵产酸量过多，破坏乳体系原本形成的三维网络结构[25]。因此，确定最适发酵时间为7 h。

表5 发酵时间对甜瓜酸奶品质的影响Table 5 Effect of fermentation time on melon yogurt quality

2.1.4 接种量的确定

由表6可知，当接种量为0.1%～0.5%时，甜瓜酸奶的酸度逐渐增加。当接种量为0.1%～0.3%时，持水力和感官评分呈增加趋势，当接种量为0.3%时，持水力和感官评分最高，分别为79.03%、85.20分，酸奶的凝固状态良好，酸甜适中，组织细腻润滑，此时，酸度为82.72°T，当接种量＞0.3%，甜瓜酸奶持水力和感官评分较低，这是因为乳酸菌的数量太少，酸奶发酵不完全，导致酸味不足，组织松散，口感不佳[26]。当接种量过大时，酸奶的酸度持续上升，而持水力和感官评分逐渐下降，其原因是添加过多的发酵剂会导致酸奶酸化过快，加速蛋白变性，凝乳时间缩短，持水力下降。因此，确定最适接种量为0.3%。

表6 接种量对甜瓜酸奶品质的影响Table 6 Effect of inoculum on melon yogurt quality

2.2 发酵条件优化响应面试验结果与分析

在单因素试验结果的基础上，以感官评分（Y）为响应值，以甜瓜汁添加量（A）、赤藓糖醇添加量（B）、发酵时间（C）、接种量（D）为自变量，进行4因素3水平的响应面试验设计。发酵条件优化响应面试验设计及结果见表7，方差分析见表8。

表7 发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 7 Results and analysis of response surface test for fermentation conditions optimization

表8 回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6软件对表7结果进行多元回归拟合分析，得到各自变量对感官评分（Y）的回归方程：Y=87.44+2.21A-2.408B+2.35C+0.31D+2.50AB+2.37AC-1.05AD+0.90BC-3.25BD+2.62CD-2.84A2-5.88B2-4.50C2-3.29D2。

由表8可知，该回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数R2=0.931 6，调整决定系数R2adj=0.900 1，表示该模型的可信度较高，可以用于甜瓜酸奶的工艺优化。由P值可知，一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2、D2对感官评分影响极显著（P＜0.01），交互项AB、BD和CD对感官评分影响显著（P＜0.05），其余项对感官评分的影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对感官评分影响的顺序为赤藓糖醇添加量＞发酵时间＞甜瓜汁添加量＞接种量。甜瓜汁添加量及赤藓糖醇添加量间、赤藓糖醇添加量及接种量间、发酵时间及接种量间交互作用影响显著（P＜0.05）。

由响应面优化得到甜瓜酸奶的最优发酵工艺参数为：甜瓜汁添加量7.40%，赤藓糖醇添加量6.74%，发酵时间7.86 h，接种量0.32%，此优化条件下，感官评分预测值为88.66分，考虑实际情况，将最佳工艺条件修正为：甜瓜汁添加量7%、赤藓糖醇添加量7%、发酵时间8 h、接种量0.3%。在此工艺条件下进行验证试验，甜瓜酸奶感官评分实际值为90.70分，与预测值接近。此时酸奶色泽均衡，凝固均匀、组织细腻且较少乳清析出，酸甜适中、口感细腻爽滑，并伴有适宜的甜瓜汁香味和浓郁的酸奶香气；其酸度为82.62°T，持水力为81.13%。

2.3 酸奶贮藏品质分析

由图1a～1c可知，随着贮藏时间在0～21 d范围内的延长，甜瓜酸奶和对照酸奶的感官评分和持水力均呈下降趋势，当贮藏时间为21 d时，感官评分和持水力分别为73.0分、68.2%；甜瓜酸奶酸度随着贮藏时间的延长从82.6°T上升到88.4°T，对照酸奶的酸度从78.6°T上升到85.6°T，这与DU H等[17]研究结果一致，可能由于乳酸菌的作用使乳糖转化为乳酸，导致pH值降低，当pH接近酪蛋白的等电点时，酪蛋白发生沉淀，这将降低酪蛋白凝胶网络及其保持水分的能力，从而使酸奶在贮藏期间大量乳清析出，组织粗糙，口味偏酸影响感官品质。而在贮藏期间甜瓜酸奶的感官评分和持水力均高于对照酸奶，酸度低于对照酸奶，这表明甜瓜酸奶的贮藏特性要优于对照酸奶。因此，甜瓜汁的添加可改善其酸奶的贮藏稳定性，使酸奶拥有更长的货架期以及较强的抗氧性。

图1 甜瓜酸奶贮藏期间品质变化Fig. 1 Quality change of melon yogurt during storage

2.3 甜瓜酸奶流变学特性

由图2可知，随着频率在0～10 Hz范围内的增加，2种酸奶样品的G′和G″值呈上升趋势，并且在整个频率范围内，G′值始终高于G″值，表明酸奶表现出具有弹性的类固态行为。在相同频率下，甜瓜酸奶的G′和G″值都高于对照酸奶，在10 Hz频率下，甜瓜酸奶G′和G″最高值分别为136.1 Pa、43.02 Pa，而对照酸奶分别为124.4 Pa、39.28 Pa，这表明优化后甜瓜酸奶表现出更似固体的行为。G′值表示酸奶的弹性特征，能有效反映蛋白质凝胶网络结构的形成[27]。甜瓜酸奶G′值的提高可归因于甜瓜汁中的多酚与酸奶酪蛋白基质的相互作用，强化蛋白质三维网络结构[28]。这表明甜瓜汁的添加有利于酸奶中蛋白质网络结构的形成。

图2 酸奶的G′频率（a）和G″频率（b）扫描曲线Fig. 2 G′ frequency (a) and G″ frequency (b) scan curves of yogurt

2.4 甜瓜酸奶的微观结构

对照酸奶和甜瓜酸奶的微观结构见3。由图3可知，所有酸奶样品都表现出较为均匀的多孔絮状蛋白质结构，对照酸奶的微观结构与甜瓜酸奶不同，对照样品结构较为稀薄、不连续，呈有间隙的蛋白质网络结构，这将导致蛋白质在贮藏期间的持水性下降。与对照酸奶相比，甜瓜酸奶显示出更均一、连续、紧密的蛋白质网络结构，有助于稳定酸奶网络，从而具有更好的流变性能和更高的持水力[27]，这一点由2.2和2.3的结果所证实。

图3 对照（a）和甜瓜（b）酸奶的微观结构Fig. 3 Microstructure of blank yogurt (a) and melon yogurt (b)

2.5 甜瓜酸奶的挥发性风味物质分析

甜瓜酸奶挥发性风味成分分析见表9。由表9可知，甜瓜酸奶的挥发性风味化合物共检出33种，包括7种醇类、9种酯类、7种醛类、4种酮类、2种酸类和4种其他类化合物，其相对含量分别为19.64%、28.43%、27.70%、11.69%、9.18%、3.36%。其中，酯类和和醛类是主要的风味物质。甜瓜酸奶的酯类物质中乙酸丁酯（柑橘、葡萄果香）、乙酸甲酯（芳香气味）、异丁酸乙酯（奶油、苹果香气）、丙酸乙酯（水果香气）、2-甲基丁基乙酸酯（青香、果香）等赋予了酸奶果具有果香和花香[29-32]。PANG X等[33]研究结果表明，甜瓜汁中酯类一般是由以γ-氨基丁酸、丙氨酸和缬氨酸为前体物质合成带支链的丁酸酯类、乙酸酯类和丙酸酯类。酸奶中较多的乙酸酯类和丙酸酯类或许是由于酸奶中添加甜瓜汁导致的。醛类化合物含有糠醛、正己醛、苯甲醛、（E）-2-壬烯醛、正壬醛、（Z）-6-壬烯醛、2,6-二甲基-5-庚烯醛。其中（E）-2-壬烯醛和（Z）-6-壬烯醛是甜瓜主要特征风味物质[34]。甜瓜汁在热处理中会产生挥发性异味物质，类似具有坚果香、杏仁味的苯甲醛，但其在酸奶成分中含量较低（0.51%）。正壬醛和正己醛可以分别为酸奶提供蜜蜡花香和苹果香[5]。酸奶中糠醛可能源自甜瓜汁生产加热过程中非酶褐变[35]。

甜瓜酸奶中薄荷醇含量最高（相对含量3.94%），呈现凉的薄荷香气。醇类化合物含量较高的是正己醇（相对含量3.79%）、异戊醇（相对含量3.66）、1-辛烯-3-醇（相对含量2.69%），是发酵乳中主要的风味活性化合物，这与CHEN X等[36]的研究报道一致。酮类化合物是酸奶中重要的风味化合物，主要包括2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-戊二酮等，可以在酸奶中提供甜味、奶油香味，大部分是不饱和脂肪酸氧化、热降解和氨基酸降解产物[32]。酸类化合物包括异丁酸和正己酸，分别为酸奶带来奶酪、芝士气味和椰子肉味的香气[32，37]。其他类化合物中存在柠檬烯、4-羟基-2（5H）-呋喃酮、（Z）-2-己烯、（Z）-3,4-二羟基呋喃。柠檬烯具有水果和柑橘风味可以为酸奶提供清新香气[38]。酸奶中4-羟基-2（5H）-呋喃酮具有坚果香、焦糖香，可能通过阿魏酸与果糖、鼠李糖、蔗糖及其他戊糖的热裂解，或由戊糖与丙氨酸和甘氨酸的美拉德反应产生[14]。

3 结论

通过单因素试验和响应面法优化获得甜瓜酸奶最佳发酵工艺条件为：甜瓜汁添加量7%，赤藓糖醇添加量7%，发酵时间8 h，接种量0.3%。在此优化工艺条件下，酸奶的酸度为82.62°T，持水力为81.13%，感官评分为90.70分，甜瓜酸奶凝固均匀，酸甜适中，伴有适宜的甜瓜汁香味和浓郁的酸奶香气。在贮藏期间，甜瓜酸奶的感官评分、酸度、持水力明显优于对照酸奶。优化后甜瓜酸奶具有较好的蛋白质网络结构。甜瓜汁酸奶共鉴定出33种挥发性化合物，7种醇类、9种酯类、7种醛类、4种酮类、2种酸类和4种其他类化合物。适量甜瓜汁的添加不仅可改善酸奶的贮藏稳定性，提高酸奶的抗氧化性，而且能丰富酸奶风味，更好地满足人们的消费需求。