LC-HRMS/MS研究富马酸替诺福韦二吡呋酯片中聚合物

2024-05-14 08:20王健松林顺权叶心睿
中国医药科学 2024年7期
关键词:三聚体液质分子离子

肖 颖 王健松▲ 袁 晓 林顺权 叶心睿

1.广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂,广东广州 510515;2.广州牌牌生物科技有限公司,广东广州 510530;3.广州白云山明兴制药有限公司,广东广州 510250

富马酸替诺福韦二吡呋酯为美国Gilead Sciences Inc.公司1988年开发,2001年在美国首次上市,适应证为艾滋病病毒(human immunodificiency virus,HIV)感染,2008年增加乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染适应证。富马酸替诺福韦酯为链末端终止剂,经水解,磷酸化形成二磷酸替诺福韦,与天然底物5’-三磷酸脱氧腺苷竞争,整合DNA后终止DNA链,从而抑制HIV-1反转录酶和HBV反转录酶的活性[1-2]。该药具有耐受性好、耐药性低、停药反跳率低、肾毒性小等特点[3-4]。对HIV感染患者,富马酸替诺福韦二吡呋酯疗效优于拉米夫定。对HBV感染患者,富马酸替诺福韦二吡呋酯疗效优于拉米夫定和阿德福韦酯[5]。聚合物杂质目前在抗生素研究中最为关注,主要包括二聚体、三聚体以及多聚体等,是引起过敏反应最可能的一个过敏源。对于有可能产生聚合物的药物进行聚合物的研究及控制,能很好地减少过敏反应的发生。富马酸替诺福韦二吡呋酯的结构及合成工艺显示有产生聚合物的可能,刘超等[6-7]对该药的杂质有定性研究,均未涉及聚合物。各类药物杂质谱分析中液-质联用技术已广泛采用,尤其是抗生素类的杂质分析中[8-15]。本研究采用液相色谱-高分辨质谱串联(liquid chromatography high resolution mass spectrometry tandem,LC-HRMS/MS)法研究富马酸替诺福韦二吡呋酯片中潜在的聚合物,并推断其结构,为富马酸替诺福韦二吡呋酯制剂的聚合物杂质控制提供参考,以减少临床过敏反应的发生。

1 材料

1.1 仪器

Q EXACTIVE Focus型质谱仪和Ultimate3000 DGLC双三元液相色谱(赛默飞世尔科技),工作站:Thermo Xcalibur Qual Browser 4.0。QUINTIX125D-1CN电子天平和PB-10酸度计[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 药品与试剂

富马酸替诺福韦二吡呋酯片(效期末,白云山制药总厂,批号:01171001,规格:0.3 g);替诺福韦酯杂质J(IP)(广州牌牌生物科技有限公司,批号:PITNFWZ-J-WHO-20191026-01);替诺福韦酯三聚体杂质2(广州牌牌生物科技有限公司,批号:PITNFWZ-SJT-2-20191025-01);乙腈、甲酸均为质谱纯(美国ThermoFisher Scientific公司),冰醋酸(江苏强盛功能化学股份有限公司),氢氧化钠(天津市津东天正精细化学试剂厂),二水磷酸二氢钠(天津市福晨化学试剂厂),十二水磷酸氢二钠和醋酸铵(福晨(天津)化学试剂有限公司)为分析纯,水为自制纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

①自制制剂:取本品1片,置100 ml量瓶中,加pH值为3.0的磷酸水(量取超纯水1 L,加磷酸调节pH值至3.0)60 ml,充分振摇使崩散,加乙腈稀释至刻度,摇匀。②杂质对照品定位溶液:称取杂质对照品替诺福韦酯杂质J(IP)和替诺福韦酯三聚体杂质2约1.0 mg,用50%乙腈水溶解并稀释至10 ml,使其浓度约为0.10 mg/ml,作为杂质对照品定位溶液。③未破坏溶液:称取制剂约0.23 g,置50 ml容量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀。④酸破坏溶液:称取制剂约0.23 g,置50 ml容量瓶中,加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,室温避光放置24 h。⑤碱破坏溶液:称取制剂约0.23 g,置50 ml容量瓶中,加0.1 mol/L氢氧化钠溶液10 ml,放置10 min,加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀。⑥高温破坏溶液:称取制剂约0.23 g,置50 ml容量瓶中,加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀,于80℃避光下放置60 min。⑦氧化破坏溶液:称取制剂约0.23 g,置50 ml容量瓶中,加30%双氧水25 ml,再加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀。⑧光破坏溶液:称取制剂约0.23 g,置50 ml容量瓶中,加稀释剂溶解并稀释至刻度,于光照箱5000lx下放置29 h,摇匀。⑨稀释剂:0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)∶乙腈(6:4)。

2.2 LC-HRMS/MS色谱条件(大气压化学离子化(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)

仪器:Q EXACTIVE Focus型质谱仪(赛默飞世尔科技);APCI+模式;喷雾电压3.8 kV;金属毛细管温度320℃;鞘气压力60 arb;辅助气压力10 arb;喷雾温度350℃。色谱柱:Inertsil Pheny1-3,4.6×100 mm,3 μm;检测波长:262 nm;流速:1.5 ml/min;柱温:30℃;进样量:20 μl;流动相A:0.05 mol/L醋酸铵缓冲液(用冰醋酸调节pH值至4.6)-乙腈(97:3);流动相B:0.05 mol/L醋酸铵缓冲液(用冰醋酸调节pH值至4.6)-乙腈(40:60)。进样前预平衡10 min。梯度洗脱见表1。

表1 洗脱条件(%)

2.3 检测结果(APCI离子源)

取“2.1”项下样品溶液,按“2.2”项下条件,进行LC-HRMS/MS测定,结果见表2,典型图谱见图1。

图1 APCI离子源下制剂LC-HRMS/MS典型图谱

表2 供试品破坏性试验及杂质对照品液质聚合物测定结果

2.4 LC-HRMS色谱条件[电喷雾离子化(electrospray ionization,ESI)]

仪器,色谱柱条件同“2.1”,仅离子源改变,梯度洗脱见表1。

2.5 检测结果(ESI离子源)

取“2.1”项下自制样品溶液,按“2.4”项下条件,进行LC-HRMS/MS测定,结果见表3,典型图谱见图2。

图2 ESI离子源下制剂LC-HRMS/MS典型图谱

表3 自制样品液质聚合物测定结果

2.6 聚合物杂质结构

2.6.1 聚合物(818)结构 聚合物(818)的准分子离子峰[M+H]+为819.26,推断结构见图3,液质结果分析见表4。聚合物(818)的准分子离子峰与理论计算误差<5 ppm,与所述结构一致,同时根据有关物质相对保留时间,确认为杂质W。

图3 聚合物(818)结构

表4 聚合物(818)的液质结果分析

2.6.2 聚合物(934)结构 聚合物(934)的准分子离子峰[M+H]+为935.31,推断结构见图4,液质结果分析见表5。聚合物(934)的准分子离子峰与理论计算误差<5 ppm,与所述结构一致,同时根据有关物质相对保留时间,确认为杂质S。

图4 聚合物(934)结构

表5 聚合物(934)的液质结果分析

2.6.3 聚合物(1050)结构及二级裂解 聚合物(1050)的准分子离子峰[M+H]+为1051.36,推断结构见图5,液质结果分析见表6。聚合物(1050)的准分子离子峰与理论计算误差<5 ppm,与所述结构一致。二级质谱裂解见图6。

图5 聚合物(1050)结构

图6 聚合物(1050)二级裂解图

表6 聚合物(1050)的液质结果分析

2.6.4 聚合物(1581)结构及二级裂解 聚合物(1581)的准分子离子峰[M+H]+为1582.53,推断结构见图7,液质结果分析见表7。聚合物(1581)的准分子离子峰与理论计算误差<5 ppm,与所述结构一致。二级裂解见图8。

图7 聚合物(1581)结构

图8 聚合物(1581)二级裂解图

表7 聚合物(1581)的液质结果分析

3 讨论

富马酸替诺福韦二吡呋酯为临床多用的抗HIV、HBV药,副作用小、耐药性低。根据结构及合成工艺可能产生过敏反应的来源之一的聚合物,有必要对其进行研究及控制,减少临床中过敏反应的发生。文献多报道该药物的杂质定性研究,尚无该药聚合物的研究报道。

目前已报道的药物聚合物检测方法主要包括葡聚糖凝胶G10色谱法、尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC)、二维柱切换质谱联用法等,本研究通过LC-HRMS/MS对其聚合物进行定性研究,分别选用APCI离子源和ESI离子源对效期末和破坏样品的聚合物杂质进行检测分析,确定聚合物杂质的结构。研究检出有二聚体:聚合物(1050)-杂质H,聚合物(818)-杂质W,聚合物(934)-杂质S;三聚体:聚合物(1581)-富马酸替诺福韦二吡呋酯三聚体杂质2。杂质H由两分子替诺福韦二吡呋酯与另外一分子酯基的亚甲基反应生成;杂质W由两分子替诺福韦单吡呋酯与另外一分子酯基的亚甲基反应生成;杂质S由替诺福韦二吡呋酯与替诺福韦单吡呋酯及另外一分子酯基的亚甲基反应生成,三个杂质均可由原料药引入或制剂中降解生成。三聚体杂质推测为原料中杂质H进一步与替诺福韦二吡呋酯在残留甲醛下共同聚合产生,减少残留甲酫的量能降低三聚体产生的概率。二聚体、三聚体为该药物过敏不良反应的源头,对聚合物进行控制能有效减少过敏反应的发生。

由于聚合物多不稳定,本研究仅对样品中稳定存在的聚合物进行了定性研究,为富马酸替诺福韦二吡呋酯制剂的反相高效液色谱法进行杂质定量控制提供参考依据。随着检测技术的不断提高,对聚合物的研究会更深入。

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