HPLC法测定蒙药沙蓬茎、叶、花中槲皮素和异鼠李素的含量

乌雅汉 莫日根 呼和 额尔敦呼 乌日汗 白明君 包书茵▲ 包桂花▲

1.内蒙古民族大学，内蒙古通辽 028000；2.内蒙古呼伦贝尔市新巴尔虎右旗阿拉坦额莫勒镇社区卫生服务中心，内蒙古阿拉坦额莫勒镇 021300；3.内蒙古自治区国际蒙医医院国家蒙药制剂中心，内蒙古呼和浩特 010020

沙蓬是蒙医常用传统药材，为藜科沙蓬Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.的干燥地上部分。蒙文名为楚力格日或楚勒格日，别名为吉刺儿[1-2]。该药始载于《四部医典》，其中曰：“楚力格日别名吉刺儿，用于疫热、毒热以及肾热症”[3]，继后《认药学》[4]《认药白晶鉴》[5]《无误蒙药鉴》[6]《辽宁植物》[7]《内蒙古蒙药材标准》[8]等著作中也见有关于沙蓬的记载。沙蓬味苦、涩，性平，效糙；具有抑疫，清热，镇赫依，解毒，利尿等功效，主要治疗疫热增盛引起的神志不清、身目黄染，希日引起的胃刺痛、口糜、齿龈溃烂、尿道灼痛、肾热等症。沙蓬中主要含有黄酮类等成分[9]，具有降糖、保护肾脏等药理作用[10-11]。

本文以沙蓬茎、叶、花为研究对象，采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）同时测定沙蓬茎、叶、花中槲皮素和异鼠李素的含量，分析比较不同部位中的分布情况，为沙蓬的研究开发提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

实验材料2022年9月采集于通辽市奈曼旗，由包桂花教授鉴定为藜科沙蓬[Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.]的茎、叶、花。槲皮素（C15H10O7）对照品（批号：100081-201610）、异鼠李素（C11H12O7）对照品（批号：110860-202012）纯度＞98%，由中检院提供，水为高纯水，甲醇为色谱纯，其他所用乙醇、磷酸、盐酸试剂等均是分析纯。

1.2 仪器

SHIMADZU SPD-20A LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津），色谱柱[Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5μm）]，AUW220D电子天平（Max 220 g d=0.01 mg，中国北京），微量进样器（中国上海），KQ-100超声波清洗器（中国昆山）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[12-13]

色谱柱为Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），选择甲醇-0.1%磷酸（58∶42）为流动相，370 nm为检测波长，30℃为柱温，1.0 ml/min为流速，10 μl为进样量。在此条件下槲皮素、异鼠李素的分离度大于1.5，对照品与供试品的色谱图（图1）。

图1 混合对照品（A）、沙蓬叶（B）、沙蓬花（C）、沙蓬茎（D）HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取槲皮素11.1 mg和异鼠李素10.1 mg，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇制成1 ml中含槲皮素0.042 69 mg和异鼠李素0.168 33 mg的混合溶液[14-15]。

2.3 供试品溶液制备

精密称取沙蓬花样品约0.1 g，置100 ml的具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20 ml，称定重量，加热回流1.5 h，放冷，称定重量，用乙醇补足减失的重量。再精密加入3.5 ml盐酸溶液，称定重量，75℃水浴中加热水解1 h，立即冷却，称定重量，用乙醇补足减失的重量。摇匀，滤过，精密量取2.0 ml续滤液，即得。详细换算公式为CX=CR/AR×AX，其中CR为标准品的浓度、AR为标准品的峰面积、CX为样品的浓度、AX为样品的峰面积。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液0.25、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。以槲皮素和异鼠李素的浓度为横坐标（x），以槲皮素和异鼠李素的峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程。依次y1=4×106x1+3039，r1=0.999 9，y2=1×106x2+6637，r2=0.999 7。结果表明，槲皮素和异鼠李素分别在0.0107～0.5336 μg、0.0421～2.1038 μg范围内与峰面积具有很好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密称取同一批次沙蓬花样品约0.1 g，制备供试品溶液，在本次试验的色谱条件下进样（n=6），测定色谱峰峰面积值。结果槲皮素和异鼠李素的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.51%和1.35%，表明仪器精密、测量值误差小。

2.6 稳定性试验

精密称取同一批次沙蓬花样品约0.1 g，制备供试品溶液，在本次试验的色谱条件下每隔2 h进样1次（n=6），共观察10 h，结果样品中槲皮素和异鼠李素的相对标准偏差为1.95%和1.05%。表明建立方法中的沙蓬花样品溶液的稳定性在10 h内良好。

2.7 重复性试验

称取同一批次沙蓬花样品约0.1 g，共6份，精密称定，在本次试验的色谱条件下进样（n=6），测定峰面积值。槲皮素和异鼠李素的相对标准偏差分别为1.88%和1.98%，结果含量测定方法具有良好的重复性。

2.8 加样回收率试验

精密称取同一批次沙蓬花样品6份，每份约0.05 g，分别加入适量的2种对照品，按2.3方法制备供试品溶液后进样测定峰面积，并计算回收率。结果沙蓬花样品溶液中2种成分的回收率分别为100.06%和102.59%，RSD分别为1.52%和1.67%。见表1～2。

表1 槲皮素回收率结果（n=6）

表2 异鼠李素回收率结果（n=6）

2.9 样品测定

分别称取沙蓬茎、叶、花约0.1 g，精密称定，按2.3项下法制备供试品溶液，在本次试验的色谱条件下进样（n=6），记录样品溶液中2种成分的色谱峰峰面积值，计算其含量。见表3～5。

表3 沙蓬茎含量测定结果（n=6）

表4 沙蓬叶含量测定（n=6）

表5 沙蓬花含量测定（n=6）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

将槲皮素和异鼠李素对照品溶液在200～400 nm进行光谱扫描，结果在370 nm时均有最大吸收并无干扰，所以选择确定370 nm为检测波长。

3.2 提取方法的选择

制备供试品溶液时对比了超声处理提取和加热回流提取，加热回流提取时槲皮素和异鼠李素的含量均高于超声处理提取，故本研究中选择加热回流提取。

3.3 考察加热回流时间

考察样品加热回流0.5、1、1.5 h，1.5 h时样品中槲皮素和异鼠李素的含量高于0.5 h和1 h，故本试验采用加热回流处理1.5 h。

3.4 柱温的选择

考察柱温分别为25℃、30℃、35℃条件对槲皮素和异鼠李素分离效果的影响，结果柱温为30℃时分离效果好于其他条件，故选择柱温为30℃。

本研究以沙蓬不同部位茎、叶、花为研究对象，建立一种同时测定槲皮素和异鼠李素含量的方法，分析比较槲皮素和异鼠李素在沙蓬茎、叶、花中的分布情况。结果表明，沙蓬茎、叶、花中槲皮素和异鼠李素的总量依次为沙蓬叶＞沙蓬花＞沙蓬茎，并且沙蓬叶中槲皮素和异鼠李素的含量最高，沙蓬茎中槲皮素和异鼠李素的含量最低；在《内蒙古蒙药材标准·2021年版》中规定，沙蓬干燥地上部分中槲皮素和异鼠李素的总量不得少于0.24%，那么，沙蓬叶和沙蓬花中2种成分的含量均高于0.24%，具有较好的研发前景，为沙蓬不同部位的研究开发提供理论参考。

在本实验所确定的色谱条件下，沙蓬茎、叶、花中槲皮素和异鼠李素的检测数据结果表明，理论塔板数按槲皮素峰计算均不低于2500，槲皮素和异鼠李素均基线分离，分离度（R＞ 1.5），拖尾因子T值分别为1.04和1.02。在方法学考察试验中槲皮素和异鼠李素峰面积的相对标准偏差值均小于2.0%，槲皮素和异鼠李素的回收率分别为100.06%、102.59%，RSD值分别为1.52%、1.67%，表明该方法结果准确，专属性强、重复性好，所建立的方法可用于蒙药沙蓬茎、叶、花中该2种成分的含量测定。