UW器官保存液转运肾活检组织对临床病理诊断的影响

李 杨,杨 眉,徐 缓,雷 松

随着现代医学技术水平的提高,肾穿刺活检术开展得越来越广泛,已成为明确肾脏疾病性质和病理类型的重要检查方法,这对确定疾病的治疗方案和预后判断有重要意义[1]。然而,肾活检涉及的几种病理检查方法在组织取材大小、所需观察肾小球数量以及固定保存方法等均存在显著差异,因此对肾活检病理组织取材有较高的要求。目前,肾活检病理组织取材均是在穿刺室现场进行,受多种因素影响导致组织取材失误较多。为此,本实验尝试使用UW器官保存液(UW液)在低温浸泡条件下转运新鲜肾活检组织到病理室集中进行规范化取材,以避免病理取材失误问题。

1 材料与方法

1.1 标本选取我院行肾活检穿刺、经体视镜观察穿刺组织中肾小球较充分的样本40例,其中一部分组织按常规肾活检病理取材,设为对照组;在保证临床病理检查的基础上,剩余的肾组织作为实验组,实验组在4 ℃预冷UW液中浸泡保存,浸泡时间分别为2 h、8 h、24 h和48 h,每组各10份样本。

1.2 保存溶液器官保存液(UW液-ViaSpan),百时美施贵宝公司生产,无菌分装至1.5 mL试管中,每管1 mL,4 ℃存放。

1.3 方法

1.3.1取材 UW液浸泡后的各实验组样本取材同对照组一致,光镜检查样本用10%福尔马林固定;电镜检查样本用戊二醛固定;免疫荧光检查样本用OCT冷冻剂冷冻包埋。

1.3.2切片及染色 光镜检查标本按常规病理组织制样处理,石蜡切片分别进行HE、过碘酸-雪夫氏(PAS)、Masson三色和过碘酸六胺银(PASM)染色;免疫荧光检查样本经冷冻切片后,进行IgA、IgG、IgM、C3、C4、C1q、κ和λ直接免疫荧光染色;电镜检查按常规组织电镜制样处理。石蜡HE切片及特殊染色切片使用普通光学显微镜观察;免疫荧光染色切片使用OLUMPUS BX41荧光显微镜观察;超薄切片使用日立H-7650型透射电子显微镜观察。

2 结果

光镜HE观察结果：2 h组肾小球和肾小管各组织结构保存良好,与对照组比较差别不明显;8 h组肾小管少量上皮细胞肿胀、脱落;24 h组肾小管上皮细胞肿胀、坏死较8 h组明显,但对观察肾小管及间质炎细胞浸润、纤维化程度等病变影响不明显;48 h组肾小管上皮细胞脱落、坏死加重,灶性小管基底带裸露,肾小球部分结构较模糊(图1)。

图1 光镜HE结果：A.对照组;B. 2 h组;C. 8 h组;D. 24 h组;E. 48 h组 图2 电镜结果：A.对照组;B. 2 h组;C. 8 h组;D.24 h组;E. 48 h组 图3 特殊染色：A.24 h组PAS染色;B.Masson染色;C.PASM染色

电镜观察结果：2 h组肾小球各组织结构和亚细胞结构保存良好,与对照组差异不明显;8 h组虽有部分肾小球亚细胞结构轻度肿胀,但对观察肾小球疾病超微结构的改变影响不明显,如肾小球各结构增生情况,基底膜厚度,足突融合程度,以及电子致密物和异常结构物质沉积部位、多少及形状等;24 h组部分病例肾小球亚细胞结构保存状态与8 h组相似,但部分病例亚细胞结构肿胀、破坏较明显,对肾小球疾病的观察有一定影响;尽管48 h组部分病例仍能观察到电子致密物沉积部位,但是肾小球各组织结构和亚细胞结构破坏较重,因此不适合进行肾小球疾病相关超微结构变化的观察(图2)。

特殊染色显示各组肾组织结构、病变结构和特殊成分均能正常着色,不受UW液浸泡时间影响。以24 h组为例,PAS染色基底膜、小球囊壁及其他PAS阳性物质呈红色;Masson染色免疫复合物呈红色、胶原纤维呈绿色;PASM染色基底膜和小球囊壁呈黑色、免疫复合物呈红色(图3)。

免疫荧光结果显示各组抗体标记阴/阳性及强弱表达不受UW液浸泡时间影响。以24 h组为例,膜性肾病组织抗体表达结果：IgG在肾小球基底膜呈线性、细颗粒状高亮度表达,κ和λ表达强度次之,C3弱表达,IgA、IgM、C4和C1q为阴性,与同病例对照组免疫荧光抗体表达结果一致(图4)。此外,狼疮性肾炎多数荧光抗体在肾小球系膜区和基底膜均有较高强度表达,呈“满堂亮”现象;而糖尿病肾病、微小病变性肾病则荧光抗体表达全部为阴性。

3 讨论

根据肾活检组织病理诊断专家共识[2-3],光镜检查需用福尔马林固定组织,切片要求观察10个及以上肾小球,因此分取的组织较大;由于电镜观察的组织要求取材准确、体积小,需用戊二醛及时固定;而免疫荧光检查组织需用等渗溶液低温保湿或OCT包被,不能使用化学固定液。基于上述原因,目前肾活检病理组织的分割和固定保存均是在穿刺手术室现场进行,然后转运到病理室进行后续制样和病理诊断工作。但是由于肾小球仅分布在肾皮质区,在观察病理切片时常发现某项检查中肾小球数量过多,而对应的其它项检查中肾小球数不足或无肾小球;有时因取材不及时,造成组织细胞肿胀、坏死较明显;另外还发现免疫荧光检查的组织因失误接触到固定液而造成免疫标记假阴性结果。分析问题原因除了肾活检组织结构特殊和病理组织取材要求复杂外,更多是穿刺现场空间局限、取材设备不足、取材人员不专业等因素。如果能将新鲜肾活检标本集中转送到病理室,在空间、取材人员和设备都具备充分条件下进行组织取材,则既能避免取材失误,又符合病理组织取材工作的标准化和规范化。

为达到上述目标,本实验选择使用器官保存液进行实验观察。目前临床用于保存和转运移植器官商品化的器官保存液较多,包括UW液、HTK液和HCA液等,采用单纯冷却法或低温灌注法处理器官都能很好地预防组织水肿和细胞破坏。有文献报道使用UW液可保存器官长达72 h,并成功用于动物器官移植[4]。我们首先使用大鼠肾组织进行了预实验,结果发现使用上述几种器官保存液低温浸泡动物肾组织,在一定时间内能较好保护组织形态和超微结构,其中UW溶液的保护作用优于其他器官保存液,但该部分实验数据未在本文列出。因此本实验选用UW液来观察其对临床肾活检病理组织形态和超微结构的保护效果,以及是否对特殊染色及免疫荧光标记结果有影响。结果显示经UW液低温浸泡8 h内肾组织形态和超微结构均改变不明显,同时不影响组织病理学的其他检查结果。但随着UW液浸泡时间延长,肾组织形态和超微结构逐渐出现受损现象,对观察肾小球疾病相关的超微结构的影响逐渐加大。同时还发现24 h组部分病例的组织超微结构破坏较轻和8 h组相似,但有的组织超微结构受损较明显,推测可能是疾病类型和病变程度不同所造成的不同生化微环境差异所引起,因此在使用UW液保存和转运肾活检组织时,时间越短越好。实验结果也表明,使用UW液未发现假阴性或假阳性现象,不影响免疫荧光染色结果,因此可作为冷冻切片组织保存和转运的常规媒介液使用。本实验还总结了一些注意事项：(1)保存液温度须控制在0～4 ℃(冰浴),如果温度过高,会影响组织保护效果。(2)浸泡的组织不能太大,保存液只适宜保存穿刺类细小组织。(3)运输过程避免剧烈震动。(4)UW液需分装、冷冻保存,临用时再解冻,以避免污染变质。本实验结果为转运新鲜病理组织标本到病理室集中进行规范化取材提供了一种新思路,能极大提高病理组织取材准确性。同时较长的组织保存时间能满足多院区或同一地区间新鲜肾活检病理标本转送,对肾活检穿刺工作有效地开展和肾脏疾病诊治水平的提高产生积极作用。