民族药九子连的化学成分及对肝癌细胞的增殖抑制作用

刘 杏,张昌龙,陈丽娅,张晓庆,高 阳,张海龙*

1.西安市高陵区妇幼保健院，西安 710200；2.西安交通大学药学院，西安 710061

九子连为兰科植物虾脊兰属流苏虾脊兰（Calanthe fimbriataFranch.）的假鳞茎和全草，为多年生草本，高20～30 cm，假鳞茎粗短，呈长卵形，整体类似牙齿状排列，是一种常用的土家族民族药，同时也属于陕西“七药”，称为“马牙七”。其味淡、微辛、苦，性凉，具有清热解毒的作用，民间主要用于治疗咽炎、肝炎及胃溃疡等。其在国内主要分布于陕西、甘肃、四川和湖北等地［1-2］。

到目前为止，国内外对该植物系统的化学成分及药理活性研究少有报道。姜祎等［2-3］用水蒸气蒸馏法提取九子连中的挥发油并用GC-MS 分析其化学成分，鉴定出38 种物质，并用琼脂扩散法研究九子连提取物的体外抑菌作用发现，九子连水提取物对痢疾志贺氏菌、乙型溶血性链球菌有抑菌作用；九子连正丁醇萃取物对痢疾志贺氏菌、乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。本课题组前期研究发现九子连甲醇提取物及其各萃取层均能提高小鼠糖耐量；通过对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠进行的抗糖尿病实验发现，九子连甲醇提取物能显著抑制STZ 诱导的糖尿病小鼠血糖的升高［4］；用各种色谱技术对九子连乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行研究，分离得到15 个化合物［5］。为进一步阐明其药效物质基础，发现结构新颖、活性优良的化合物，继续对九子连进行化学成分及生物活性研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

制备型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（PuriMaster 5000）、SuPer-Max 3100 全波长多功能酶标仪均购自上海科哲生化科技有限公司；Megres C18分析型色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Megres C18半制备型色谱柱（250 mm× 10.0 mm，5 μm）均购自江苏汉邦科技有限公司；AVANCE III HD 400 MHz 型核磁共振仪、AVANCE III HD 600 MHz 型核磁共振仪均购自德国Bruker公司；RP-C18（德国Merck 公司）。

1.2 试药

甲醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等实验所用试剂均为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂；胰蛋白酶（美国Hyclone 公司）；胎牛血清（美国Gibco 公司）；DMSO、MTT 等均购自美国Sigma 公司。柱层析硅胶（100～200 目，200～300 目，青岛海洋化工有限公司）；DMEM 培养基（美国Hyclone 公司）。

九子连于2021年采集于陕西宁强，经西安交通大学生药学系牛晓峰教授鉴定为九子连（Calanthe fimbriataFranch.）的干燥根茎，凭证标本（编号JZL 211118）现保存于西安交通大学药学院。

1.3 细胞

人肝癌HepG2 细胞（西安交通大学第一附属医院药剂科）。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取于阴凉处晾干的九子连根茎10.0 kg。将其粉碎，用甲醇冷浸后加热回流提取，甲醇提取液经减压浓缩得到九子连甲醇总提取物1.6 kg。将浸膏分散于适量蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压浓缩后得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层。

取九子连正丁醇层样品70 g，经硅胶（200～300目，500 g）柱色谱进行分离，以氯仿-甲醇（1∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1）进行梯度洗脱，收集样品，经薄层色谱检识合并后，共得到15 个流份（Bu-1～Bu-15）。Bu-8 经ODS 柱色谱进行分离，以甲醇-水（10∶90～100∶0）进行梯度洗脱得到10 个流份（Bu-8-1～Bu-8-10）。Bu-8-7 经HPLC（甲醇-水：45∶55）分离纯化得化合物1（7.0 mg）。Bu-8-5 经HPLC（甲醇-水：40∶60）分离纯化得化合物2（5.0 mg）。Bu-8-3 经Sephadex LH-20 柱色谱，以甲醇为洗脱剂分离纯化得到化合物3（29.0 mg）。Bu-12 经ODS 柱色谱进行分离，以甲醇-水（10∶90～100∶0）进行梯度洗脱得到10 个流份（Bu-12-1～Bu-12-10）。 Bu-12-1经HPLC（甲醇-水：7∶93）分离纯化得到化合物4（2.4 mg）和化合物5（3.3 mg）。Bu-9 经ODS 柱色谱进行分离，以甲醇-水（10∶90～100∶0）进行梯度洗脱得到8 个流份（Bu-9-1～Bu-9-8）。Bu-9-3 经HPLC（甲醇-水：18∶82）分离纯化得化合物6（3.8 mg）。Bu-7 经ODS 柱色谱进行分离，以甲醇-水（10∶90～100∶0）进行梯度洗脱得到6 个流份（Bu-7-1～Bu-7-6）。Bu-7-5经HPLC（甲醇-水：35∶65）分离纯化得到化合物7（4.6 mg）。Bu-7-7 经HPLC（甲醇-水：45∶55）分离纯化得到化合物8（15.0 mg）。

九子连乙酸乙酯层样品85.7 g，经硅胶（200～300 目，600 g）柱色谱进行分离，用氯仿-甲醇（1∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1）进行梯度洗脱，收集并合并相同流份后，共得到33 个流份（EA-1～EA-33）。EA-14 用硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（3∶1、2∶1）进行梯度洗脱得4 个流份（EA-14-1～EA-14-4）。EA-14-3 经HPLC（甲醇-水：60∶40）分离纯化得化合物9（2.0 mg）。 EA-22经HPLC（甲醇-水：20∶80）分离纯化得化合物10（2.0 mg）。EA-16 经Sephadex LH-20 柱色谱纯化，以甲醇为洗脱剂分离得到化合物11（6.0 mg）。

取九子连石油醚层样品102.3 g，用硅胶（200～300 目，700 g）柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（1∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1）进行梯度洗脱，收集并合并相同流份后，共得到33 个流份（PE-1～PE-33）。PE-9 经硅胶（200～300 目）柱色谱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯（20∶1）进行洗脱，得到2 个流份（PE-9-1～PE-9-2）。PE-9-1 经PTLC以石油醚-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，纯化得到化合物12（5.0 mg）。PE-11 经硅胶（200～300 目）柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（20∶1）进行洗脱得到3 个流份（PE-11-1～PE-11-3）。PE-11-3 经PTLC 以石油醚-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂分离纯化得化合物13（2.0 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：无定形粉末，易溶于甲醇，分子式为C16H28O7。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：1.25（3H，s，H-9），1.54 （2H，m，H-5），1.67 （3H，s，H-10），2.09 （2H，m，H-4），3.20 （1H，m，H-2＇），3.22（1H，m，H-5＇），3.27 （1H，m，H-4＇），3.34 （1H，m，H-3＇），3.66 （1H，dd，J= 11.8，5.6 Hz，H-6＇a），3.85（1H，m，H-6＇b），4.03 （1H，d，J= 11.5 Hz，H-8a），4.19 （1H，d，J= 11.5 Hz，H-8b），4.24 （1H，d，J=7.8 Hz，H-1＇），5.04 （1H，dd，J= 10.8 Hz，H-1a），5.20 （1H，d，J= 17.5 Hz，H-1b），5.48 （1H，t，J=7.1 Hz，H-6），5.91 （1H，dd，J= 17.4，10.8 Hz，H-2）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD），δC：112.1 （C-1），146.2 （C-2），73.8 （C-3），42.9 （C-4），23.5 （C-5），130.1 （C-6），132.9 （C-7），75.9 （C-8），27.6 （C-9），14.1 （C-10），102.6 （C-1＇），75.1 （C-2＇），78.2（C-3＇），71.7 （C-4＇），77.9 （C-5＇），62.8 （C-6＇）。以上数据与文献报道一致［6］，故鉴定化合物1 为betulalbuside A。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇，分子式为C19H30O7。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：5.86（3H，m，H-4，7，8），1.03 （3H，s，H-11），1.04 （3H，s，H-12），1.29 （3H，d，J= 6.4 Hz，H-10），1.92 （3H，s，H-13），2.15 （1H，d，J= 17.0 Hz，H-2a），2.53 （1H，d，J= 17.0 Hz，H-2b），4.42 （1H，m，H-9），4.34（1H，d，J= 7.8 Hz，H-1＇），3.85 （1H，m，H-2＇），3.33（1H，s，H-3＇），3.25 （2H，m，H-4＇，5＇），3.62 （1H，dd，J= 11.7，5.3 Hz，H-6＇a），3.17 （1H，m，H-6＇b）。13CNMR（100 MHz，CD3OD），δC：42.4 （C-1），50.7 （C-2），201.2 （C-3），127.2 （C-4），167.3 （C-5），80.0（C-6），131.5（C-7），135.3 （C-8），77.3 （C-9），21.2 （C-10），23.4 （C-11），24.7 （C-12），19.6 （C-13），102.7 （C-1＇），75.3 （C-2＇），78.1 （C-3＇），71.7（C-4＇），78.0 （C-5＇），62.8 （C-6＇）。以上数据与文献报道一致［7］，故鉴定化合物2为roseoside。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇，分子式为C9H12N2O6。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：8.03（1H，d，J= 8.1 Hz，H-6），5.92 （1H，d，J= 4.5 Hz，H-1＇），5.71 （1H，d，J= 8.1 Hz，H-5），4.20 （1H，m，H-3＇），4.17 （1H，m，H-2＇），4.02 （1H，m，H-4＇），3.83（1H，dd，J= 12.2，2.2 Hz，H-5＇a），3.74 （1H，dd，J= 12.2，2.7 Hz，H-5＇b）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD），δC：152.6 （C-2），166.2 （C-4），102.8 （C-5），142.7 （C-6），90.6 （C-1＇），71.3 （C-2＇），75.7 （C-3＇），86.5 （C-4＇），62.3 （C-5＇）。以上数据与文献报道一致［8］，故鉴定化合物3为尿苷。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，分子式为C18H26O12。1H-NMR （600 MHz，CD3OD），δH：6.76（1H，d，J= 2.7 Hz，H-2），6.71 （1H，d，J= 8.6 Hz，H-5），6.62 （1H，dd，J= 8.6，2.7 Hz，H-6），4.77 （1H，d，J=7.6 Hz，H-1＇），4.36 （1H，d，J= 7.8 Hz，H-1＇），3.84 （3H，s，3-OMe ）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD），δC：152.7 （C-1），103.8 （C-2），149.3 （C-3），143.0 （C-4），116.1 （C-5），109.9 （C-6），103.5 （C-1＇），74.9 （C-2＇），77.3 （C-3＇），70.0 （C-4＇），77.8 （C-5＇），61.4 （C-6＇），104.8 （C-1＇），71.6 （C-2＇），75.1 （C-3＇），71.4 （C-4＇），62.7 （C-5＇），56.5 （3-OMe）。以上数据与文献报道一致［9］，故鉴定化合物4 为4-羟基-3-甲氧基苯基β-D-吡喃木糖基（1→6）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，分子式为C19H28O13。1H-NMR （600 MHz，CD3OD），δH：6.49（2H，s，H-2，6），4.79 （1H，d，J= 7.5 Hz，H-1＇），4.33（1H，d，J= 7.8 Hz，H-1＇），3.83 （6H，m，3，5-OMe），13C-NMR（150 MHz，CD3OD），δC：152.3 （C-1），149.4（C-3，5），96.7 （C-2，6），132.1 （C-4），103.6 （C-1＇），74.9 （C-2＇），77.8 （C-3＇），71.6 （C-4＇），77.2 （C-5＇），70.4 （C-6＇），105.0 （C-1＇），75.1 （C-2＇），78.1 （C-3＇），71.4 （C-4＇），62.7 （C-5＇），56.9 （3，5-OMe）。以上数据与文献报道一致［10］，故鉴定化合物5 为arctiiphenolglycoside A。

化合物6：无色针晶，易溶于甲醇，分子式为C14H20O7。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：7.05（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），6.67 （2H，d，J= 8.5 Hz，H-3，5），2.81 （2H，m，H-7），4.02 （1H，m，H-8a），3.85 （1H，m，H-8b），4.27 （1H，d，J= 7.8 Hz，H-1＇）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD），δC：130.8 （C-1），156.8 （C-4），130.9 （C-2，6），116.1 （C-3，5），36.4 （C-7），72.1 （C-8），104.4 （C-1＇），75.1 （C-2＇），78.0 （C-3＇），71.7 （C-4＇），78.1 （C-5＇），62.8 （C-6＇）。以上数据与文献报道一致［11］，故鉴定化合物6 为salidroside。

化合物7：无色油状物，易溶于甲醇，分子式为C11H22O6。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：3.95（1H，dt，J= 9.4，7.0 Hz，H-1a），3.56 （1H，dt，J=9.5，6.9 Hz，H-1b），1.52 （2H，q，J= 6.9 Hz，H-2），1.69 （1H，m，H-3），0.92 （6H，d，J= 6.7 Hz，H-4，5），4.24 （1H，d，J= 7.8 Hz，H-1＇）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD），δC：104.4 （C-1＇），75.1 （C-2＇），78.1（C-3＇），71.7 （C-4＇），77.9 （C-5＇），62.8 （C-6＇），69.3（C-1），39.6 （C-2），26.1 （C-3），23.0 （C-4，5）。以上数据与文献报道一致［12］，故鉴定化合物7 为3-methylbutan-1-ol-β-D-glucopyranoside。

化合物8：无定形粉末，易溶于甲醇，分子式为C16H28O7。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：5.23（1H，dd，J= 17.5，1.1 Hz，H-1a），5.01 （1H，dd，J=10.8，1.2 Hz，H-1b），5.99 （1H，dd，J= 17.5，10.8 Hz，H-2），1.95 （2H，m，H-4a，5a），1.81 （2H，m，H-4b，5b），4.06 （1H，t，J= 7.0 Hz，H-6），1.22 （3H，s，H-8），1.25 （3H，s，H-9），1.34 （3H，s，H-10），4.50（1H，d，J= 7.7 Hz，H-1＇），3.15 （1H，m，H-2＇），3.37（1H，m，H-3＇），3.25 （2H，m，H-4＇，5＇），3.82 （1H，dd，J= 11.9，2.0 Hz，H-6＇a），3.63 （1H，dd，J= 11.9，5.2 Hz，H-6＇b）。13C NMR （100 MHz，CD3OD），δC：112.2 （C-1），145.3 （C-2），84.6 （C-3），38.6 （C-4），28.4 （C-5），86.9 （C-6），80.6 （C-7），24.0 （C-8），20.9 （C-9），26.1 （C-10），98.7 （C-1＇），75.1 （C-2＇），77.9 （C-3＇），71.7 （C-4＇），77.6 （C-5＇），62.8 （C-6＇）。以上数据与文献报道一致［13］，故鉴定化合物8 为trans-linalool-3，6-oxide-β-D-glucopyranoside。

化合物9：白色粉末，易溶于甲醇，分子式为C20H24O6。1H-NMR （600 MHz，CD3OD），δH：6.67（1H，d，J= 1.7 Hz，H-2），6.74 （1H，d，J= 8.0 Hz，H-5），6.61 （1H dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-6），1.76 （1H，t，J= 10.0 Hz，H-8），3.39 （1H，dd，J= 11.2，4.0 Hz，H-9a），3.66 （2H，m，H-9b，H-9＇b），3.70 （1H，dd，J=10.9，4.9 Hz，H-9＇a），6.65 （1H，s，H-2＇），6.18 （1H，s，H-5＇），2.77 （2H，d，J= 7.5 Hz，H-7＇），3.78 （1H，m，H-7），2.00 （1H，s，H-8＇），3.77 （3H，s，3-OCH3），3.81 （3H，s，3＇ -OCH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD），δC：138.6 （C-1），113.8 （C-2），149.0 （C-3），146.0 （C-4），116.0 （C-5），123.2 （C-6），48.0（C-7），48.0 （C-8），62.2 （C-9），129.0 （C-1＇），112.4（C-2＇），147.2 （C-3＇），145.3 （C-4＇），117.4 （C-5＇），134.2 （C-6＇），33.6 （C-7＇），40.0 （C-8＇），65.9 （C-9＇），56.4 （3＇-OCH3），56.3 （3-OCH3）。以上数据与文献报道一致［14］，故鉴定化合物9为（+）-isolariciresinol。

化合物10：白色粉末，易溶于水，分子式为C10H13N5O4。1H-NMR （400 MHz，D2O），δH：8.29（1H，s，H-8），8.19 （1H，s，H-2），6.03 （1H，d，J=6.1 Hz，H-1＇），4.76 （1H，m，H-2＇），4.41 （1H，s，H-3＇），4.27 （1H，s，H-4＇），3.90 （1H，d，J= 12.8 Hz，H-5＇a），3.82 （1H，d，J= 13.0 Hz，H-5＇b）。13CNMR（100 MHz，D2O），δC：152.3 （C-2），148.2 （C-4），118.8 （C-5），155.3 （C-6），140.4 （C-8），88.3（C-1＇），70.6 （C-2＇），73.7 （C-3＇），85.7 （C-4＇），61.4（C-5＇）。以上数据与文献报道一致［15］，故鉴定化合物10为腺苷。

化合物11：白色粉末，易溶于甲醇，分子式为C17H17NO3。1H-NMR （400 MHz，CD3OD），δH：7.42（1H，d，J= 15.7 Hz，H-3），6.36 （1H，d，J= 15.7 Hz，H-2），7.36 （2H，d，J= 8.6 Hz，H-5，9），7.04 （2H，d，J= 8.4 Hz，H-6，8），6.78 （2H，d，J= 8.5 Hz，H-5＇，7＇），6.71 （2H，d，J= 8.4 Hz，H-4＇，8＇），3.43 （2H，d，J= 8.2 Hz，H-1＇），2.73 （2H，d，J= 8.2 Hz，H-2＇）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD），δC：169.2 （C-1），131.3 （C-2），141.8 （C-3），127.7 （C-4），130.6 （C-5，9），116. 2 （C-6，8），160.5 （C-7），42.6 （C-1＇），35.8 （C-2＇），118.4 （C-3＇），130.7 （C-4＇，8＇），116.7（C-5＇，7＇），156.9 （C-6＇）。以上数据与文献报道一致［16］，故鉴定化合物11 为N-反式-对羟基苯乙基香豆酰胺。

化合物12：白色粉末，易溶于氯仿，分子式为C16H16O4。1H-NMR （400 MHz，CDCl3），δH：6.71（1H，s，H-1），6.97 （1H，dd，J= 8.1，1.0 Hz，H-6），7.16 （1H，t，J= 7.7 Hz，H-7），6.86 （1H，d，J=7.2 Hz，H-8），2.73 （2H，dd，J= 8.8，4.0 Hz，H-9），2.66 （2H，dd，J= 9.9，5.1 Hz，H-10），3.95 （3H，s，2-OCH3），3.76 （3H，s，4-OCH3）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3），δC：108.0 （C-1），146.4 （C-2），137.3（C-3），142.7 （C-4），119.3 （C-4a），119.9 （C-4b），153.8 （C-5），118.1 （C-6），128.5 （C-7），120.1 （C-8），140.7 （C-8a），31.4 （C-9），30.8 （C-10），132.4（C-10a），56.5 （2-OCH3），62.1 （4-OCH3）。以上数据与文献报道一致［17］，故鉴定化合物12 为marylaurencinol A。

化合物13：棕色粉末，易溶于氯仿，分子式为C16H16O4。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：7.86（1H，s，H-5），6.78 （1H，s，H-8），6.42 （1H，d，J=2.2 Hz，H-1），6.35 （1H，s，H-3），3.91 （3H，s，4-OCH3），3.88 （3H，s，7-OCH3），2.68 （4H，s，H-9，10）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3），δC：107.5 （C-1），154.5 （C-2），98.2 （C-3），157.5 （C-4），114.3 （C-4a），125.0（C-4b），113.5（C-5），144.4（C-6），142.7 （C-7），111.2 （C-8），129.5 （C-8a），30.8 （C-9），29.0 （C-10），141.2 （C-10a），56.1 （7-OCH3），55.7 （4-OCH3）。以上数据与文献报道一致［18］，故鉴定化合物13为callosin。

2.3 肝癌细胞增殖抑制活性的测定

用MTT 法检测分离得到的13 个化合物对人肝癌HepG2 细胞的增殖抑制作用，以5-氟脲嘧啶（fluorouracil，5-FU）为阳性对照。将细胞接种于96 孔板内，在37 °C、体积分数为5% 的 CO2恒温培养箱中培养24 h，待细胞贴壁生长后，弃去培养基，加入200 μL 预先配好的含不同浓度（3、10、30、100 μmol·L-1）化合物的新鲜培养基，同时设空白对照组（200 μL DMEM 高糖完全培养基），每个浓度设3 个复孔，置于37 °C、体积分数为5% 的CO2培养箱中培养48 h 后，向每孔加入20 μL MTT 溶液，继续培养4 h 后，吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，置于恒温振荡器上振摇10 min 至结晶完全溶解，用酶标仪在490 nm 处测定吸光度值。

活性测定结果表明，化合物13 对HepG2 细胞表现出了一定的增殖抑制作用，在100 μmol·L-1的浓度下，其对HepG2 细胞的抑制率达到了44.8%，其余化合物对HepG2 细胞的增殖抑制作用均较弱。

3 讨论

民族药是我国少数民族的智慧结晶，理应得到继承和发展，尤其是人数较少的民族因其无本民族文字，故对民族药及时加以研究和发扬显得更加迫切和必要。同时，陕西“七药”也是我国陕西及周边地区的重要民间药，“七”是“奇”的变音，是具有奇特疗效的意思，作为中国传统医药文化的重要组成部分，“七药”在维护人民健康中发挥重要的作用。继承和发展我国的特色民族药和民间药，不仅可以丰富和完善我国的传统医药体系，还能促进当代医药事业的发展。

本论文在前期研究的基础上，进一步阐明了土家族民族药九子连的化学成分，13 个化合物均为首次从该植物中分离鉴定得到，包括生物碱、木脂素、二氢菲、核苷、芳香苷、单萜苷、环酮苷和脂肪醇苷等，可见九子连的化学成分复杂，结构类型多样。在这些化合物中，二氢菲类化合物callosin 对人肝癌HepG2 细胞具有一定的增殖抑制作用。该研究为民族药九子连的进一步深入研究奠定了实验基础，也为对其进行综合开发、利用提供了科学依据。