脂联素基因多态性与直肠腺瘤切除预后相关性分析

张慧英,刘 冰,刘国华,王 琳,杨邯平

(河北省邯郸市第一医院 普外科,056000)

直肠腺瘤(rectal adenoma,RA)泛指直肠黏膜表面向肠腔突出的赘生物,主要有腺瘤、息肉病、儿童型息肉以及炎症息肉等[1]。有研究[2-3]报道,>95%的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)起源于RA,具有切除后易复发等特点。因此,寻找RA的复发因素对防治CRC具有十分重要的意义。脂联素(adiponectin,APN)由脂肪细胞特异性分泌,具有多种生物活性,能够减轻胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、保护心脑血管,参与抗炎、抗肿瘤作用[4]。APN基因存在多位点基因多态性,包括rs2241766、rs1501299、rs17300539和rs266729等[5]。研究[6]表明,CRC和RA病人病变组织中APN水平低于正常人群,且CRC病人病变组织中更低。研究[7]发现,APN基因2号外显子的rs2241766基因多态性与血清APN水平改变有关,与妊娠糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖等也有密切关系[8-10]。本研究探讨RA病人APN基因rs2241766位点多态性与预后的相关性,旨在为临床治疗RA提供参考。现作报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月至2018年6月于我院接受切除手术治疗的RA病人97例,根据RA切除预后诊断标准[11],将复发RA病人52例作为观察组,其中男28例,女24例,年龄54～74岁;无复发RA病人45例作为对照组,其中男26例,女19例,年龄55～75岁。纳入标准:(1)病人均经组织病理学检查确诊;(2)具有完整的临床病理学及血液学资料;(3)有可进行基因组分析的全血或组织标本;(4)具备详细的随访信息,无临床病历资料缺失。排除标准:(1)经病理证实息肉已经癌变;(2)妊娠或正准备妊娠的妇女、哺乳期妇女;(3)大肠家族性腺瘤性息肉或息肉病病人;(4)患有严重心、肺、肝、肾等功能不全者。本研究经病人及家属知情同意,且经我院医学伦理委员会批准通过,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂和仪器

全血基因组DNA快速抽提试剂盒(美国OMEGA公司),Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA ladder、限制性内切酶SmaⅠ(赛默飞世尔生物科技有限公司),PCR分析仪(北京智杰方远科技有限公司),低温高速离心机(美国Thermo Scientific公司),APN ELISA试剂盒(深圳晶美生物),-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo公司),移液枪(德国Eppendorf公司),引物由上海英骏生物工程公司合成。

1.3 基因组DNA提取及扩增

RA复发检测前,收集所有病人空腹静脉血2 mL于抗凝管中,置-80 ℃冰箱保存待用。经常规解冻后采用全血基因组DNA快速抽提试剂盒提取外周血基因组DNA,严格按照操作说明书进行。PCR扩增反应体系:灭菌双蒸水14.2 μL,10×PCR缓冲液2 μL,dNTP 1.6 μL,正向引物与反向引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s,以上三个步骤循环35次,最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取出离心备用,对产物进行纯化。采用限制性内切酶SmaⅠ酶切鉴定。酶切反应体系:10×Buffer 1.5 μL,0.1×BSA 1.5 μL,SmaI 0.8 μL,PCR产物DNA 6 μL,ddH2O 5.2 μL。单管反应体积15 μL。反应条件:37 ℃下温浴2 h,10×Buffer 1.5 μL终止反应。酶切产物以3.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后,采用凝胶成像系统分析单核苷酸多态性基因型结果。APN基因rs2241766位点引物序列见表1。

1.4 观察指标

记录并比较RA病人切除术后复发情况,包括腺瘤数量、腺瘤最大径及平均直径。

1.5 统计学方法

采用方差分析、q检验、χ2检验、Hardy-Weinbery平衡检测和logistics回归分析。

2 结果

2.1 APN基因rs2241766位点基因型多态性

SmaⅠ酶切结果显示,APN基因rs2241766位点基因型多态性基因PCR产物为372 bp,包含T等位基因的片段没有酶切位点,含G等位基因的片段有酶切位点。野生纯合型(TT基因型)为372 bp;突变杂合型(TG基因型)为372 bp、209 bp及163 bp;突变纯合型(GG基因型)为209 bp及163 bp(见图1)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡定律检验

根据Hardy-Weinberg平衡定律,对照组与观察组APN基因rs2241766位点各基因型的期望值和观察值进行检验,P均>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡定律,提示群体来自同一孟德尔群体,所选样本进行群体遗传学研究具有代表性(见表2)。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.3 APN基因rs2241766位点多态性分析

观察组和对照组APN基因rs2241766位点基因型及等位基因频率差异均有统计学意义(P<0.01)(见表3)。

表3 2组病人APN基因rs2241766位点多态性分析[n;百分率(%)]

2.4 复发RA病人APN基因rs2241766位点多态性与腺瘤病理特征关系

观察组病人中,野生TT型、突变杂合子TG型、突变纯合子GG型病人腺瘤数、腺瘤最大径及平均直径间差异均有统计学意义(P<0.01),其中TG型、GG型腺瘤数、腺瘤最大径及平均直径均大于TT型(P<0.05),GG型亦均大于TG型(P<0.05)(见表4)。

表4 APN基因rs2241766位点多态性与腺瘤病理特征关系

2.5 RA病人切除术后复发的影响因素分析

以RA切除术后是否复发为因变,结果显示,APN基因rs2241766位点杂合子TG型、突变纯合子GG型均为RA病人切除术后复发的危险因素(P<0.01)(见表5)。

表5 RA预后复发的危险因素分析

3 讨论

RA发病率为5%～30%,其与CRC关系密切,研究[12]表明,内镜下及时发现和摘除RA可降低至少76%的CRC发生率。对于年龄>50岁、腺瘤多发、直径>3 cm、管状绒毛状或绒毛状腺瘤切除后病人的随访时间不应超过3年,否则复发或恶化概率非常高[13]。及早治疗、控制大肠疾病以防其进一步发展为CRC,对降低CRC发病率尤为重要。研究[4,14]表明,APN可能参与能量代谢、抗血管生成及抗肿瘤的过程,RA病人血清APN表达水平明显降低,血清中相对较低的APN可能会导致细胞恶性化及异常增殖。APN编码基因位于染色体3q27区,人APN由244个氨基酸构成,基因组包括2个内含子及3个外显子,全长约16 kb,该基因上关键氨基酸的改变可导致APN结构和功能的改变,从而影响其生物学功能[15]。其中rs2241766位点T/G多态性中,T→G突变能够降低机体APN表达,导致糖脂代谢紊乱及炎症反应,与肿瘤发生、胰岛素抵抗有一定相关性[16]。本研究结果显示,APN基因rs2241766位点有野生型(TT)、杂合子型(TG)、纯合子型(GG),且各基因型分布频率服从Hardy-Weinberg平衡定律,提示所选样本来自同一孟德尔群体,所选样本进行群体遗传学研究具有代表性。

目前国内外关于APN基因rs2241766位点多态性研究多集中在与CRC的相关性上,鲜有与RA切除后复发情况的报道。李政等[17]报道APN基因rs2241766位点多态性与东亚人种CRC发生有一定相关性,与欧罗巴人种无明显相关性;刘文辉等[18]验证APN基因rs2241766位点、rs1501299位点均与CRC有关。但鉴于CRC的发生多由RA导致,因此研究APN基因多态性与RA病人切除术预后的关系十分必要。本研究发现,与对照组相比,观察组APN基因rs2241766位点TG、GG基因型及G等位基因频率均升高;杂合子TG型腺瘤数、腺瘤最大直径及平均直径均大于野生TT型,突变纯合子上述指标亦均大于杂合子TG型。提示APN基因rs2241766位点T→G突变可能在RA切除后复发的病理机制中发挥作用。进一步分析发现,APN基因rs2241766位点杂合子TG型、突变纯合子GG型是RA切除术后复发的危险因素,进一步提示APN基因rs2241766位点基因多态性与RA复发具有相关关系,可对TG型、GG型病人加强随访并及早介入治疗,可能有利于改善RA病人预后。

综上,APN基因rs2241766位点TG、GG基因型及G等位基因频率的升高,与RA切除后复发有一定相关性。本研究存在一定不足,样本选择受制于地区、例数、人群,需进一步扩大地区、扩大样本量,以进一步证实APN基因突变与RA切除后复发的关系。