富硅或富磷育秧降低水稻砷含量的效果及其分子机制

贾梦凡,李燕丽,王兴祥,周志高,丁昌峰②

〔1.湿地生态与农业利用教育部工程研究中心/ 长江大学农学院,湖北 荆州 434025;2.土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所),江苏 南京 210008;3.中国科学院大学,北京 100049〕

砷(As)是我国农田主要的重(类)金属污染物之一,2014年《全国土壤污染状况调查公报》表明,我国2.7%的土壤样点As含量超标。由于水稻自身的特性及淹水栽培模式,其富集As的能力远远大于其他旱作物[1],稻米是人体摄入As的主要食物来源[2]。硅(Si)是水稻的有益元素,磷(P)是水稻的必需元素,对水稻的高产稳产十分关键。由于硅酸和亚砷酸具有相似的解离常数和分子大小,三价砷〔As(Ⅲ)〕可以通过硅酸的转运通道蛋白OsLsi1进入水稻根系,进而通过OsLsi2在根中进行横向运输进入木质部。因此,施Si可调控水稻对As的吸收以及转运[3];由于五价砷〔As(Ⅴ)〕与P有非常相似的化学性质和结构,水稻根系可通过P吸收通道吸收As(Ⅴ),再通过P的转运子(OsPT1、OsPT4、OsPT8)进入细胞[4]。

前人对外源添加Si或P调控As在水稻体内的积累进行了较多研究。例如,在自然土壤中(As含量≤15 mg·kg-1),添加10～20 g·kg-1硅酸形态的Si肥可降低水稻秸秆和糙米中As含量,降幅可达65%～78%和11%～23%[5-6]。但Si肥如果用量不当,反而会通过促进土壤固相对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)以及二甲基砷(DMA)的释放,增加土壤溶液中As浓度,提高土壤中As的生物有效性[7-8]。此外,在营养生长阶段,叶面喷施Si可显著降低水稻糙米中总As、无机砷及二甲基砷的积累[9]。但由于作物叶片对于养分的吸收效果受到自身营养状况、生育时期、环境条件以及叶面肥种类等多种因素的影响,叶面喷施的效果不太稳定[10]。雷鸣等[11]通过盆栽试验证明,向As污染土壤中施用磷酸氢二钠或羟基磷灰石能使糙米总As含量显著降低8%～22%。但由于P能够通过离子交换作用置换出土壤中的As[12-13],在水稻生育期内施用大量的磷肥反而会增加土壤As的生物有效性[14]。

除此之外,也有研究证实内源Si或P对于苗期水稻降As有显著作用。通过水培试验研究发现,营养液中提前1～2周加入0.5～2 mmol·L-1的Si进行水稻幼苗培养,再进行As(Ⅴ)暴露,可以使地上部和根系As(Ⅴ)含量分别降低37%和22%,表明内源Si可显著调控水稻对As(Ⅴ)的吸收转运[15]。WANG等[16]研究表明,水稻幼苗体内P含量较低的情况下对As更敏感。因此,为避免出现土壤施Si或P提高土壤溶液中As有效性的情况以及叶面喷施效果不稳定的问题,在水稻育秧阶段进行Si或P元素富集,增加水稻内源Si或P含量,可能是调控水稻吸收和累积As的一个有效措施。但目前关于秧苗富集Si或P对移栽后水稻糙米As含量的影响鲜见报道。

因此,该研究拟通过育秧过程中添加不同浓度硅酸和磷酸盐以获取富Si或P秧苗,以期筛选出能够有效降低糙米As含量的最优浓度,研究富Si或P秧苗对 Si和 P 的积累特征及移栽后水稻植株对 As 的吸收转运特征,明确富Si或P秧苗对于糙米的降As效果及机制,为As超标农田安全利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试水稻品种

供试水稻品种为“天优华占”籼型三系杂交稻,全生育期123 d左右。

1.2 植物培养

秧苗培育在中国科学院南京土壤研究所温室进行,水稻种子用φ=30.0%的H2O2消毒15 min,去掉瘪粒,用去离子水洗净后置于25 ℃黑暗环境中浸种24 h,再转移至湿润纱布中催芽48 h,挑选出芽状况良好且一致的种子置于浮板上进行育苗。育苗期间保证每个处理水稻种子数大致相同。育苗初期采用1/2水稻营养液培育3 d,再用正常浓度营养液进行培养。营养液培养实验为每3 d进行1次营养液的更换育苗过程,水稻营养液采用木村B营养液(pH值5.6),具体成分包括0.36 mmol·L-1(NH4)2SO4、0.55 mmol·L-1MgSO4·7H2O、0.18 mmol·L-1KNO3、0.37 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、0.18 mmol·L-1KH2PO4、20 μmol·L-1FeSO4·7H2O、20 μmol·L-1EDTA-Na2、0.50 μmol·L-1MnCl2·4H2O、3.0 μmol·L-1H3BO3、1.0 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.40 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.20 μmol·L-1CuSO4·4H2O。

盆栽试验供试土壤为采自江西赣州的As污染水稻土,土壤pH值为5.19,有机质含量为34 g·kg-1,总As含量为49.1 mg·kg-1。

1.3 试验设计

秧苗培育在中国科学院南京土壤研究所温室进行,水稻种子消毒、浸种、催芽后进行育苗。育苗初期采用1/2水稻营养液培育3 d,再进行Si、P处理,以硅酸(由K2SiO3溶液过氢型阳离子交换树脂Amberlite IR 120制备而得)以及磷酸二氢钾的形式加入。共包括5个处理,分别如下:(1)全水稻营养液(CK);(2)全水稻营养液+ 5 mmol·L-1Si (Si1);(3)全水稻营养液+ 8 mmol·L-1Si(Si2);(4)全水稻营养液+ 2 mmol·L-1P(P1);(5)全水稻营养液+ 4 mmol·L-1P (P2)。

每3 d更换1次营养液,培育25 d后获得富Si或富P水稻幼苗,采集部分水稻幼苗分析地上部及地下部生物量和Si、P积累量,筛选出较优富集浓度下的富集秧苗用于土壤盆栽试验。水稻幼苗移栽前一周,进行盆栽试验装土和添加基肥等前处理。每盆装5 kg风干土,装土过程中拌入基肥:0.20 g·kg-1N(尿素)、0.15 g·kg-1P2O5〔Ca(H2PO4)2·H2O〕、0.20 g·kg-1K2O(KCl),加水保持土壤湿润,平衡1周左右。所有处理均设置3次重复。水稻幼苗培育25 d后移栽到盆栽土壤中,每盆种植2株,移栽后保持土壤淹水,水稻种植至成熟期收获。

1.4 样品采集

采集水培25 d后各处理水稻幼苗,幼苗根系在0.50 mmol CaCl2溶液中浸泡20 min,去除根表吸附的元素,清洗干净后分成根系和茎叶,75 ℃烘干并测定各部位干物质质量以及Si、P含量。另取部分富集秧苗,擦干根系表面营养液后迅速做好标记并放入液氮中,转移至-80 ℃冰箱中保存,待提取 RNA,测定砷相关转运基因(OsLsi1、OsLsi2、OsPT1、OsPT4、OsPT8、OsABCC1)的相对表达量。水稻成熟后采集根系、茎叶、稻穗,根系及茎叶经去离子水清洗干净后75 ℃烘干并测定总As含量,稻谷经砻谷机去壳后获得糙米,冷冻干燥后消解测定各形态As含量。

1.5 样品处理与测定

1.5.1样品中元素含量的测定

样品中Si含量采用w=50%的NaOH高压灭菌法消解并用分光光度计测定[17];样品中P含量采用湿式消解钼锑抗比色法测定[18];总As含量采用硝酸-过氧化氢消解[19],电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)测定。

1.5.2样品中As形态的提取与测定

采用φ=15%的硝酸热浸提法提取,液相色谱-电感耦合等离子质谱法(LC-ICP/MS)测定,色谱柱为反相柱[19]。

1.5.3As相关转运基因相对表达量的测定

在液氮中将待测水稻根系研磨成粉末状,采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取总RNA。采用核酸仪(美国赛默飞NanoDrop ND-1000)测定各样品总RNA浓度,采用反转录试剂盒〔南京诺唯赞HIScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)〕和PCR仪(日本Takara)对RNA进行反转录过程合成cDNA。OsLsi1、OsLsi2、OsPT1、OsPT4、OsPT8、OsABCC1等基因的荧光定量过程采用荧光定量试剂盒(南京诺唯赞Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix)、RT-PCR仪(美国伯乐CFX96)完成。

1.6 数据处理

以根-茎为例,转运系数(TF,FT)的计算方法为茎As含量与根As含量的比值,表示As由水稻根系向茎转运的能力。

采用Excel 2021和SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA),采用Duncan多重比较进行显著性检验,GraphPad Prism 8软件作图,采用Origin 2021软件作相关性热图。

2 结果与分析

2.1 富Si或富P育秧对水稻幼苗吸收Si或P的影响

不同浓度处理下富Si秧苗中Si含量如表1所示。Si1和Si2处理下秧苗的生长没有受到抑制,地上部与根系Si含量与对照相比均显著增加,且Si1处理根系Si含量显著高于Si2。Si1和Si2处理下地上部Si含量分别增至对照的1.9 和1.8倍,根系Si含量分别增至对照的2.3 和 2.0倍,秧苗整株Si吸收量与对照相比也呈显著增加趋势,分别增至对照的19.6和18.3倍。

表1 不同浓度处理富Si秧苗生物量及Si含量

不同浓度处理下富P秧苗中P含量如表2所示。P1处理下秧苗生长没有受到抑制,但P2处理地上部生物量较对照显著降低7.7%;地上部与根系P含量与对照相比均显著增加,P1和P2处理根系P含量分别增至对照的2.1和2.6倍,地上部P含量分别增至对照的2.2和 2.3倍,秧苗整株P吸收量与对照相比也呈显著增加趋势,分别增至对照的2.3和2.1倍。

表2 不同浓度处理富P秧苗生物量及P含量

由于Si1处理下秧苗整株Si吸收量略高于Si2处理,而与P1相比,P2处理秧苗地上部的生物量显著降低,影响了水稻正常生长。据此,笔者选择Si1和P1这2个浓度处理的富集秧苗,并将其移栽至As污染土壤中进行盆栽试验。

2.2 富Si或富P育秧对水稻产量及各部位As含量的影响

表3为富Si或富P秧苗移栽至As污染土壤后的产量以及各部位总As含量。富Si或富P处理对于水稻产量没有显著影响。从表3可知,与对照相比,Si1处理糙米和叶总As含量分别降低31.1%和16.8%,水稻根总As含量显著增加22.7%,茎总As含量没有显著变化;与对照相比,P1处理水稻根系和茎总As含量分别显著增加13.4%和16.0%,糙米、水稻叶的总As含量均没有显著变化。

表3 富Si或富P秧苗移栽后的水稻产量及各部位总As含量

2.3 富Si或富P育秧对水稻体内As转运的影响

富Si或富P育秧可不同程度影响水稻各部位之间As的转运系数。由图1可知, Si1处理使得水稻各部位间As转运系数均显著降低;P1处理水稻根-茎、根-叶转运系数与对照相比无显著差异,但茎-叶、茎-糙米的转运系数显著降低。

CK—全水稻营养液;Si1—全水稻营养液+5 mmol·L-1 Si;P1—全水稻营养液+2 mmol·L-1 P。同一幅图中直方柱上方小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.4 富Si或富P育秧对糙米As形态的影响

糙米As形态测定的试验过程中并未检测出一甲基砷的存在。图2为最优Si或P浓度水稻秧苗培育至成熟期后所获糙米的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)以及DMA含量。从图2可以看出,与常规育秧相比,富Si育秧使得糙米中3种形态As含量均显著降低,下降率分别达32.1%、58.3%、33.5%,其中无机砷含量〔As(Ⅲ)与As(Ⅴ)总含量〕显著降低37.3%;富P育秧使得As(Ⅴ)含量降低59.2%,但对于糙米中As(Ⅲ)和DMA含量没有显著影响,其中无机砷含量有降低趋势,但与对照相比无显著差异。

CK—全水稻营养液;Si1—全水稻营养液+5 mmol·L-1 Si;P1—全水稻营养液+2 mmol·L-1 P。同一组直方柱上方小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.5 富Si或富P育秧对As转运基因相对表达量的调控

富Si育秧会显著影响As相关转运基因的相对表达量。图3表明,与对照相比,富Si育秧对OsLsi1的相对表达量没有显著影响,使OsLsi2的相对表达量下降26%,OsABCC1的相对表达量上调203%。

同一组直方柱上方小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

富P育秧也会显著影响As相关转运基因的相对表达量。由图4可见,与常规育秧相比,富P育秧使OsPT1、OsPT4及OsPT8的相对表达量分别下降26%、51%和71%,OsABCC1的相对表达量上调22%。

同一组直方柱上方小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.6 水稻不同组织As含量与秧苗Si或P吸收量及转运基因表达量的相关性分析

相关性分析结果(图5)表明,水稻糙米无机砷含量与秧苗Si吸收量、成熟期水稻根As含量、OsABCC1的相对表达量呈显著负相关关系,与OsLsi1、OsLsi2的相对表达量以及成熟期水稻叶总As含量呈显著正相关关系,与其他因素相关性不显著。根系总As含量与秧苗Si吸收量、OsABCC1的相对表达量呈显著正相关关系,与OsLsi2的相对表达量呈显著负相关关系。OsLsi1和OsLsi2的相对表达量与秧苗Si吸收量呈显著负相关关系,OsABCC1的相对表达量与秧苗Si吸收量呈显著正相关关系,这表明富Si抑制了OsLsi1和OsLsi2基因的表达,且诱导了OsABCC1的过量表达。OsLsi1与根系吸收Si、As有关,OsLsi2与木质部转运Si、As有关,OsABCC1与根系液泡固定重金属螯合物有关,表明富Si秧苗可能通过调控OsLsi1、OsLsi2以及OsABCC1的表达,从而抑制水稻植株As含量,进一步影响糙米As含量。

*表示P<0.05,**表示P<0.01。

图6显示,糙米无机砷含量与OsABCC1的相对表达量呈显著负相关关系,与秧苗P吸收量呈负相关关系,与As相关转运基因的相对表达量呈正相关关系。水稻成熟期根、茎总As含量与秧苗P吸收量呈显著正相关关系,与OsPT1、OsPT4和OsPT8的相对表达量呈负相关关系,与OsABCC1的相对表达量呈显著正相关关系,这说明秧苗富P在一定程度上可以影响水稻体内As的转运。OsPT1、OsPT4和OsPT8的相对表达量与秧苗P吸收量呈负相关关系,OsABCC1的相对表达量与秧苗P吸收量呈显著正相关关系,这说明秧苗富P抑制了OsPT1和OsPT4的表达,诱导了OsABCC1的过量表达。OsPT1和OsPT4与根系吸收P、As有关,OsABCC1与根系液泡固定重金属螯合物有关,表明富P秧苗可能通过调控OsPT1、OsPT4以及OsABCC1的表达,从而抑制水稻植株对As的吸收并增强根系对于As的滞留,进一步影响糙米As含量。

*表示P<0.05,**表示P<0.01。

3 讨论

笔者试验结果表明,适宜Si或P浓度下培育出的秧苗对于成熟期糙米中As含量有降低作用,富Si秧苗显著降低了糙米As(Ⅲ)含量,富P秧苗显著降低了糙米As(Ⅴ)含量,且富Si或P秧苗根系中As相关转运基因的相对表达量均呈现显著下降趋势。一般来说,在稻田土壤溶液中As主要以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的形态存在[20],而在水稻根系中,单硅酸〔Si(OH)4〕和亚砷酸〔As(OH)3〕共用同一吸收通道蛋白OsLsi1,水稻在吸收单硅酸时会吸收亚砷酸进入体内[21-22],单硅酸进入水稻体内后由OsLsi2向木质部运输,进一步向地上部转运。As(Ⅴ)由于化学性质与磷酸盐相似,主要通过磷酸盐转运蛋白OsPT4、OsPT8进入水稻根系细胞[23-24]。由于水稻为典型的Si高积累植物,P是植物生长所必需的大量元素,而As为非必需元素,转运蛋白可能会优先转运必需的营养元素以满足水稻生长需求。当水稻组织中Si或P元素充足时,相关转运基因的表达会受到抑制,从而影响水稻根系对As的转运吸收。CHEN等[25]也发现,施用铁肥抑制了根系OsIRT1、OsNramp1和OsNramp5等基因的表达,进而降低了水稻对As的吸收。

试验发现,5 mmol·L-1Si富集处理显著降低糙米As(Ⅴ)含量,这是由于As(Ⅴ)通过磷酸盐通道进入水稻根系后,一部分通过磷酸盐转运蛋白进入木质部和韧皮部向上运输,另一部分会被还原成As(Ⅲ)[26]。被还原的As(Ⅲ)部分被隔离在液泡中,部分通过转运蛋白OsLsi2等由木质部和韧皮部向上运输[27],富Si处理通过影响这一部分As(Ⅲ)的转运从而影响糙米中As(Ⅴ)含量。有研究证实,水稻水通道蛋白OsLsi1会介导甲基砷的吸收[28],这可能是Si1处理能够显著降低糙米中DMA含量的原因。

相较于对照,Si或P富集秧苗显著增加了成熟期水稻根系中总As含量,一方面是富Si或富P处理增加了水稻根系中转运基因OsABCC1的相对表达量,而OsABCC1负责将As(Ⅲ)转运并固定在液泡中,抑制了As(Ⅲ)在水稻体内的向上转运[29],增强了As在根系中的滞留;另一方面,富Si或富P处理降低了As相关转运基因OsLsi2、OsPT4、OsPT8的相对表达量,阻碍了As的向上转运,也在一定程度上增强了As在根系中的滞留[23-24,27]。

试验结果显示,相较于对照,5 mmol·L-1Si富集处理显著降低了糙米中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA含量及水稻糙米总As含量,而2 mmol·L-1P富集处理仅显著降低As(Ⅴ)含量,对糙米总As含量没有显著影响。这可能是因为稻田淹水条件会促进土壤微生物对As的还原和甲基化[30],使得淹水条件下土壤环境中As形态以As(Ⅲ)和DMA为主,导致糙米中的As主要以DMA和As(Ⅲ)为主。WANG等[31]对于湖南As污染水稻土(总As含量为38.2 mg·kg-1)的盆栽试验同样发现,稻米中有机砷占比(77%)显著高于无机砷(23%)。

综上所述,适宜浓度的Si肥和P肥培育后的秧苗均可降低糙米中As含量,且与2 mmol·L-1富P育秧相比,5 mmol·L-1富Si育秧降As效果更好。富Si或富P育秧是一项低成本、轻简化的As污染稻田安全利用技术,能够突破大田全生育期繁琐的控As技术弊端,不会对大田土壤产生次生障碍风险,且此方法降低了过度施用Si或P肥造成农业面源污染的隐患。

需要指出的是,笔者虽然研究了富Si或富P秧苗对水稻植株的降 As 效果,但并未探讨苗期富集水稻对于水稻整个生育期的持续影响,且仅为初步研究结果,需进一步深入研究其生物学机制。此外,该试验仅探讨了单一水稻品种富Si或富P育秧的降As效果,对于不同品种的普适性还需要进一步研究。

4 结论

(1)研究筛选出的适宜富Si或富P育秧浓度均显著增加了秧苗体内Si或P含量,且对水稻生长没有显著影响。

(2)5 mmol·L-1Si育秧处理能够调控As相关转运基因OsLsi1、OsLsi2以及OsABCC1的表达,增强As在水稻根系中的滞留,显著降低糙米中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA含量。

(3)2 mmol·L-1P育秧处理能够调控As相关转运基因OsPT1、OsPT4、OsPT8以及OsABCC1的表达,增强了As在水稻根系中的滞留,显著降低糙米中As(Ⅴ)含量。