通过式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中的氯米芬、曲美他嗪和美度铵

宋 娟，李 君，张阳阳，姚蕾珺，肖全伟，李绍波,*，戴 琴,*

（1.成都市食品检验研究院，四川 成都 611130；2.国家市场监管重点实验室（营养与健康化学计量及应用），北京 100029）

氯米芬是具有顺、反异构的N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺化合物，稳定性较差，通常以枸橼酸盐形式存在[1-2]。盐酸曲美他嗪属哌嗪类衍生物，化学名为1-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪二盐酸盐，是一种抗心肌缺血的代谢性药物，具有降低血管阻力、增加冠脉及循环血流量、促进心肌代谢、降低心肌耗氧量、改善心肌氧的供需平衡、增强心脏功能的作用[3]。美度铵，又称米屈阱，最初作为一种生长促进剂用于动物养殖，此外，作为左旋肉碱抑制剂，在欧洲作为临床药物治疗糖尿病、神经退行性疾病和支气管肺疾病。就运动表现而言，对运动员运动能力、耐力以及运动后恢复均有促进作用[4]。因此，2016年，世界反兴奋剂中心将美度铵列入《禁用清单》S4激素及代谢调节剂。为了避免食品来源的兴奋剂污染，国家体育总局也于2021年发布《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》，要求大型赛事举办方对食品中的食源性兴奋剂进行检测，把氯米氛、曲美他嗪和美度铵同时归为代谢调节剂。其中氯米芬的参考检出限为1 μg/kg；曲美他嗪的参考检出限为2 μg/kg；美度铵的参考检出限为20 μg/kg。检测对象为畜禽肉及其制品、水产品及其制品、蛋及其制品、奶及其制品，除此之外，曲美他嗪的检测对象还包括所有经厂家加工过的烹调调味品（如油、盐、酱、醋、料酒、味精、鸡精、蚝油等），检测对象多，基质较为复杂。

现有氯米芬、曲美他嗪和美度铵的检测方法主要包括液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、超临界色谱-串联质谱法、液相色谱-高分辨质谱法等[5-14]。液相色谱检测法分析时间长，且易受基质干扰，满足不了痕量分析的需要；超临界色谱-串联质谱法分析速度快，但正相色谱柱易受样品中水的影响，不适合长期、大批量样品的分析。质谱仪作为高效液相色谱的检测器，大大提高了仪器的灵敏度和检测范围。三重四极杆质谱仪具有高效的对已知目标化合物定量检测的能力，目前已广泛应用于食品中多种药物残留的检测。通过多反应离子监测的扫描模式，能大大减少复杂基质样品中的背景干扰，提高目标化合物的检测灵敏度，保证分析结果的准确性。

目前，氯米芬、曲美他嗪和美度铵的绝大多数检测方法是建立在药品、尿液及血液基质中，食品中的检测方法报道较少。由于食品样品种类复杂，基质干扰效应明显，因此对样品前处理方法提出了更高的要求。而目前还鲜有食品中同时检测氯米芬、曲美他嗪、美度铵3 种代谢调节剂的报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸橼酸氯米芬（纯度99.0%）、曲美他嗪（纯度99.9%）、美度铵（99.0%）、氯米芬-D5盐酸盐（纯度98.5%）、曲美他嗪二盐酸盐-D8（纯度98.7%）和美度铵-D3（100.0 μg/mL）的标准品购于天津阿尔塔科技有限公司。

甲酸、甲醇、乙腈、甲酸铵、正己烷（均为色谱纯）德国Merck公司；氯化钠、二甲基亚砜（均为分析纯）重庆川东化工（集团）有限公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美国Waters公司；安捷伦Elut净化包 美国Agilent公司；实验用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》实验室一级用水。本研究过程中所用100余批次样品均购自于市场。

1.2 仪器与设备

1290+6470超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪美国Agilent公司；Centrifuge 5810R高速离心机 德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；Multi reax全能型振荡器 德国Heidolph公司；BP211D型天平 德国Sartorius公司；ORTEX3旋涡混匀器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准物质的配制

1.3.1.1 标准溶液配制

标准储备溶液：准确称取适量枸橼酸氯米芬、曲美他嗪和美度铵标准品，分别用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成氯米芬（折算成枸橼酸后）、曲美他嗪和美度铵质量浓度各为1 000 μg/mL的标准储备液，-18 ℃保存。

混合标准中间溶液：分别准确吸取不同体积的氯米芬、曲美他嗪和美度铵标准储备溶液于同一棕色容量瓶中，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，摇匀得混合标准中间溶液（氯米芬、曲美他嗪质量浓度为0.2 μg/mL，美度铵质量浓度为1.0 μg/mL）。

1.3.1.2 同位素内标标准溶液配制

同位素内标储备液：分别准确称取氯米芬-D5盐酸盐、曲美他嗪二盐酸盐-D8和美度铵-D3标准品适量（准确至0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成氯米芬-D5（折算盐酸后）、曲美他嗪-D8（折算盐酸后）和美度铵-D3质量浓度各为100 μg/mL的同位素内标储备液，-18 ℃保存。

混合同位素内标中间工作液：分别准确吸取不同体积的氯米芬-D5、曲美他嗪-D8和美度铵-D3同位素内标储备液至同一棕色容量瓶中，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，摇匀得混合同位素内标标准溶液（氯米芬-D5、曲美他嗪-D8质量浓度为0.2 μg/mL，美度铵-D3质量浓度为1.0 μg/mL）。

1.3.1.3 标准溶液配制

分别吸取不同体积的混合标准中间溶液和500 μL的混合同位素内标标准溶液于不同10 mL容量瓶中，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，摇匀，待测。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取

固态和半固态样品：准确称取均质样品2 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入100 μL混合同位素内标中间工作液，加入均质子、5 mL水，涡旋混匀5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈溶液，涡旋混匀10 min，超声30 min，再加入8 g氯化钠，涡旋混匀1 min，于9 500 r/min、4 ℃冷冻离心5 min，取上清液于另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，涡旋混匀5 min，于9 500 r/min、4 ℃冷冻离心5 min，弃去正己烷层，下层溶液待净化。

液态样品：准确称取均质样品2 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入100 μL混合同位素内标中间工作液，加入3 mL水，涡旋混匀5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈溶液，涡旋混匀10 min，超声30 min，再加入8 g氯化钠，涡旋混匀1 min，于9 500 r/min、4 ℃冷冻离心5 min，取上清液于另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，涡旋混匀5 min，于9 500 r/min、4 ℃冷冻离心5 min，弃去正己烷层，下层溶液待净化。

1.3.2.2 净化

取10 mL下层溶液过PRiME HLB小柱，收集滤液于氮吹管中，加入50 μL二甲基亚砜，40 ℃氮吹至近干，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至1 mL，混匀，过0.22 μm有机滤膜，上机待测。

1.3.3 超高效液相色谱-串联质谱条件

1.3.3.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸-乙腈溶液，B为20 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）；检测方式：多重反应监测模式；干燥气（氮气）温度：300 ℃；干燥气（氮气）流量：10 L/min；雾化气（氮气）压力：35 psi；鞘气温度：300 ℃；鞘气（氮气）流量：11 L/min；毛细管电压：3 500 V；监测离子对和质谱参数见表2。

表2 3 种代谢调节剂检测的质谱条件Table 2 Mass spectrometric parameters for three metabolic regulators

1.4 数据处理

采用MultiQuant 3.0.2数据处理系统对样品中的3 种代谢调节剂进行超高效液相色谱-串联质谱分析、数据采集和处理，采用Origin 2023进行统计计算和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

分别将100 μg/L单一标准溶液注入离子源，进行一级质谱全扫描，在最佳碎裂电压下确认目标化合物的母离子m/z值，然后进行二级质谱优化，优化碰撞能量，对碎片离子进行全扫描，选取响应最强与次强的碎片离子作为定量和定性离子[15]。

实验发现所有被测物均在ESI+下具有较强的信号值，3 种代谢调节剂均可获得较高丰度的[M+H]+峰。在优化干燥气温度、干燥气流量、雾化气压力、鞘气温度、毛细管电压等离子源条件后，得到质谱条件参数，结果见表2。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱选择

本研究考察了ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）3 种色谱柱对待测化合物的分离效果。在同一流动相条件下，美度铵在C18色谱柱出峰速度过快，峰形较差，且易被内源性杂质（如乙酰胆碱同位素、赖氨酸和谷氨酸等）干扰[12]；采用HILIC柱，美度铵出峰时间靠后，峰形较宽；而采用Amide柱，3 种目标物出峰时间、峰形和分离度均可以满足要求。因此，最终选择ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）作为目标物分离的色谱柱，美度铵在C18柱、Amide柱和HILIC柱上的色谱峰比较见图1。

图1 美度铵在C18柱（A）、Amide柱（B）和HILIC柱（C）上的色谱峰比较Fig.1 Comparison of chromatographic peaks of meldonium on C18 (A),Amide (B) and HILIC (C) columns

2.2.2 流动相的选择

选择乙腈作为流动相的有机相，并加入0.1%甲酸优化峰形。考察5 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）、10 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）、20 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）、50 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）4 种不同浓度的甲酸铵溶液作为流动相对3 种物质的分离效果影响，结果表明4 种溶液均能达到目标物出峰、分离的要求，综合考虑峰形、对称度及流动相含盐量，本方法选择20 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）溶液作为流动相的水相。3 种化合物的总离子流色谱图见图2。

图2 3 种代谢调节剂标准溶液总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatograms of mixed standard solution of three metabolic regulators

2.3 提取条件优化

目前针对该类物质的提取溶剂有甲醇、甲醇-水、乙腈、乙腈-水等。乙腈具有沉淀蛋白、与油脂相容性较差等特点[16]，本研究选择乙腈作为基础提取溶剂，分别用乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈、6%甲酸-乙腈对猪肉中3 种代谢调节剂的提取效率进行考察，结果见图3。结果表明，乙腈中加入甲酸可提高3 种目标物的提取效率，且随甲酸含量增加美度铵的提取效率明显提高，甲酸体积分数大于5%后，提取效率无明显变化。本研究选择5%甲酸-乙腈作为提取溶剂。

图3 5 种提取溶剂的提取效率对比Fig.3 Comparison of extraction efficiencies of five solvents

2.4 净化方式优化

由于食品中含有大量脂溶性杂质、色素等干扰物，容易干扰仪器检测，因此选择适宜的净化方式对方法的建立尤为关键。目前主流的净化方式有固相萃取小柱[17-18]、QuEChERS[19-21]、液液分散萃取[22]等净化方式。本研究分别考察了QuEChERS（C18100 mg+乙二胺-N-丙基硅烷（primary second amine，PSA）硅胶100 mg+石墨化碳50 mg）、安捷伦Elut净化包和PRiME HLB小柱（200 mg/6 mL）的净化效果，以猪肉为基质的净化效果见图4。结果表明，3 种净化方式对氯米芬的回收率影响差别不大。而采用QuEChERS和安捷伦Elut净化包两种净化方式时，曲美他嗪回收率大于120%；由于内源性的杂质干扰严重[12]，采用QuEChERS方式净化时，美度铵回收率甚至大于200%。PRiME HLB小柱填料是一种新型的反相固相萃取吸附剂，具有免活化，操作简单，能有效去除蛋白、盐、磷脂等95%以上的基质干扰物，使样品基质效应更小等优点[23-25]。本研究在采用PRiME HLB小柱净化时，美度铵的内源性杂质干扰信号明显降低，3 种目标物的回收率在80%～110%之间，均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》对回收率的要求。因此采用PRiME HLB小柱作为本研究的净化方式。

图4 不同净化方式的回收率对比Fig.4 Comparison of recoveries of different purification methods

2.5 基质效应

使用超高效液相色谱-串联质谱法检测食品过程中可能带入不同程度的基质效应，基质效应的存在直接影响到检测结果的准确性[26-29]，因此本研究将对所建立方法的基质效应进行评估。

称取适量份数的17 种空白基质样品，除不加入同位素内标标准溶液外均按照1.3.2节获取空白样品提取液。分别使用空白样品提取液和90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）按照1.3.1.3节配制标准曲线工作液，以基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值考察3 种代谢调节剂的基质效应。若基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值在0.85～1.15之间，则认为不存在基质效应的影响，反之则存在基质效应。3 种目标物的基质效应结果见图5。结果表明在17 种基质中3 种代谢调节剂均存在较大的基质效应，因此本研究采用同位素内标法做定量分析，从而减少基质效应对实际样品测定的干扰。

图5 基质效应考察Fig.5 Evaluation of matrix effect

2.6 线性关系、检出限与定量限

采取在空白试样中逐级降低加标浓度的方式确定3 种代谢调节剂的检出限和定量限。同时在不同基质中加入检出限和定量限水平的标准物质，按照1.3.2节和1.3.3节的方法进行检测。结果表明不同基质中检出限水平的各代谢调节剂其定性离子对、定量离子对信噪比均大于3；定量限水平的各代谢调节剂其定性离子对、定量离子对信噪比均大于10。氯米芬和曲美他嗪在1.0～40.0 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好；美度铵在5.0～200.0 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好。相关结果见表3。

表3 3 种被测物对应的内标化合物、线性范围、线性方程、决定系数、检出限及定量限Table 3 Internal standards,linear ranges,linear equations,determination coefficients (R2),limits of detection and limits of quantification of three metabolic regulators

2.7 方法回收率与精密度

依据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》，分别称取猪肉、肉肠、牛肉、培根、鸡肉、牛奶、酸奶、奶酪、鸡蛋、卤蛋、花鲢、扇贝、淡水虾、豆瓣酱、蚝油、鸡精、菜籽油空白基质样品，按照定量限、2 倍定量限和10 倍定量限进行3水平添加实验（n＝6），按照1.3.2节和1.3.3节方法进行样品处理和检测，考察所确定方法的回收率和精密度[30]。如表4所示，本方法的平均回收率在81.3%～100.7%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.3%～6.1%之间。

表4 方法加标回收率及RSD（n ＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the developed method (n=6)

2.8 实际样品测试

采用本方法对购自于市场的畜禽肉及含畜禽肉制品、水产品及含水产制品、蛋及含蛋制品、奶及含奶制品、植物油及含植物油制品以及烹调调味料等共100余批次样品进行3 种代谢调节剂的检测，均未检出阳性样品。

3 结论

本研究建立了通过式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱的检测方法，分别对前处理方法、色谱和质谱条件进行优化，采用多反应监测模式检测，同时测定食品中的氯米氛、曲美他嗪和美度铵。该方法具有灵敏度高、普适性强、操作简便等优点，可为体育赛事的食品保障工作提供有效的技术支撑。