MMP14调控骨骼肌卫星细胞分化的分子机制研究

刘 媛,李溪月,张维娅

(河北农业大学 河北省山区农业技术创新中心,保定 071000)

骨骼肌是人体运动和代谢的重要器官,在维持身体的运动平衡、葡萄糖代谢[1]和能量代谢[2]等方面起着非常重要的作用。骨骼肌由肌纤维组成,肌纤维是一类含有可收缩功能肌原纤维的圆柱形多核细胞[3]。骨骼肌的生成主要包括胚胎期肌纤维数目的增加和出生后肌纤维的成熟发育。脊椎动物骨骼肌的发育主要起源于胚胎时期的轴旁中胚层,此后轴旁经过增生和肥大分裂形成体节,体节经过进一步发育形成腹侧生骨节和背侧生皮肌节,生皮肌节发育成肌节,肌节最终形成全身骨骼肌[4]。卫星细胞在骨骼肌形成过程中作为前体的一个子集,也起源于中胚层祖细胞[5]。

骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中的成体干细胞。Mauro[6]在1961年首次从青蛙骨骼肌纤维中分离出一类紧密粘附于肌纤维基膜的单核细胞,命名为卫星细胞。卫星细胞定位于骨骼肌微环境中,是骨骼肌中具有增殖分化潜能的肌源性干细胞。卫星细胞的功能受PAX7、MYOD以及MYF5等转录因子调控,在肌纤维的生长发育以及损伤修复过程中发挥重要作用[7]。通常情况下,卫星细胞在体内稳态中以静息状态存在于肌纤维基膜(基底膜)和肌细胞膜之间[8]。骨骼肌发育或受到损伤时,卫星细胞会被激活并进入细胞周期,激活后的卫星细胞具有增殖、迁移、以及分化融合成肌管的能力,对维持机体稳态有重要作用[9-10]。肌纤维受损时,卫星细胞中肌源性因子MYOD表达上调,细胞开始大量增殖并迁移到受损伤部位,随后肌源性转录因子MYOG和MRFs以及下游的效应因子表达,最终分化融合成新的肌纤维,重塑受损的肌纤维[11-13]。Lyu等[14]研究发现,牛卫星细胞可能由转录状态、增殖速率和肌源性潜能不同的亚群组成。Cai等[15]的研究揭示了骨骼肌发育的不同阶段之间不同亚群细胞的比例差异显著,且特定的转录因子会在肌发生过程中调节细胞命运的转变。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是锌依赖性内肽酶,在细胞多种生理功能中发挥作用。MMP14(也称MT1-MMP)是MMPs家族的重要成员,是一种膜型基质金属蛋白酶,定位于细胞膜上[16]。Knapinska和Fields[17]通过MMP14在蛋白质图谱中的亚细胞定位揭示了这种蛋白酶主要定位于胞质溶胶和细胞骨架的中间丝。MMP14作为跨膜蛋白连接细胞外基质和细胞内组分,对卫星细胞的分化过程有重要影响。有研究表明,MMP14可以降解细胞外基质的所有成分,包括纤维胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白以及纤维蛋白等,是参与细胞外基质重塑的重要蛋白[18]。MMP14在骨骼肌损伤修复中发挥作用。Ohtake等[19]的结果证明了MMP14可维持肌纤维功能完整性,在成肌分化过程中,通过表观遗传影响肌源性调控因子的表达从而调节肌源性分化,抑制MMP14会导致肌源性障碍,表现为肌纤维融合受损以及肌管形成减少。Hotaryk等[20]证明,MMP14是 MMPs家族中唯一在富含胶原蛋白的环境中促进细胞迁移的蛋白酶。Ito等[21]发现,用诱导MMP14过表达和激活的因子刀豆球蛋白A对成肌细胞进行预处理有利于改善成肌细胞的迁移。因此,MMP14在调节骨骼肌卫星细胞的迁移、分化和再生以及维持肌纤维功能完整性中具有重要作用。

虽然前人研究发现MMP14在卫星细胞分化和骨骼肌发育方面发挥重要作用,但研究多聚焦于MMP14介导ECM重塑调控肌纤维发育方面[22]。目前,MMP14直接调控卫星细胞肌源性分化的分子机制尚不明确。本课题组在前期研究中分析不同年龄骨骼肌卫星细胞的分化能力及分子机制,结果发现MMP14的表达水平在骨骼肌发育的不同阶段差异显著,且作为关键节点参与调控细胞分化相关的效应因子,表明MMP14可能参与调控卫星细胞肌源性分化。MMP14作为金属基质蛋白酶可以水解多种基质和非基质蛋白,因此本研究通过蛋白组测序分析卫星细胞中MMP14调控的关键蛋白,解析MMP14调控卫星细胞分化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选用4周龄C57/BL6雌性小鼠,小鼠全部购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。所有动物实验均在生物实验室进行,并经河北农业大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 试验材料

胶原酶(Sigma,C1639)、胰酶(Gibco)、磷酸盐缓冲液(Gibco),RPMI 1640培养基(Gibco,21870076)、胎牛血清(Gibco,10082-147)、马血清(Gibco,16050122)、鸡胚胎提取物(GEMINI,100-163)、Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)、DMEM/HIGH GLUCOSE(Hyclone,SH30 022.01B)、TransZol(Invitrogen,411503)、反转录试剂盒(Takara,RR064A),SYBR qPCR Mix(TOYOBO,246000),哺乳动物蛋白提取试剂(Pierce,CT301337100)。

1.3 仪器设备

低速台式离心机(TD5B,BIORIDGE)、Axio Observer倒置显微镜系统(蔡司)、细胞培养箱(MCO-18AC)、紫外凝胶成像系统(EBOX CX5,Vilber lourmat)、荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 6)Tanon 5200多成像系统(Tanon)、双板垂直电泳仪(北京六一生物技术有限公司,DYCZ-24DH)等。

1.4 试验方法

1.4.1 卫星细胞的分离和培养 每次细胞分离需要10只4周龄的野生型雌性C57/BL6小鼠。卫星细胞分离步骤参考本课题组之前研究中所描述的方法。具体方法如下:取小鼠后肢骨骼肌样本,用胶原酶(2 mg·mL-1)在37 ℃下消化肌肉组织60 min;然后,将消化后的悬液通过100目网过滤,将过筛后的液体离心,利用PBS悬浮沉淀,随后用200目和400目筛过滤;过筛后离心,用RPMI 1640培养基洗涤沉淀,离心后用生长培养基悬浮(含有15%胎牛血清、鸡胚胎提取物、0.25 μg·100 mL-1碱性成纤维细胞生长因子和RPMI 1640培养基),转移至普通赖氨酸包被的培养皿中,置于37 ℃的细胞培养箱培养;2.5 h后转移到经基质胶包被的培养皿。分化培养基由DMEM高糖培养基和3%(v/v)马血清配制而成。

1.4.2 细胞转染 细胞汇合至约60%时使用转染试剂Lipofectamine 2000进行siRNA的转染,转染步骤按说明书操作。siRNA和阴性对照由锐博生物技术有限公司(中国,广州)提供。

1.4.3 免疫荧光试验 在卫星细胞中分别转染si-MMP14和si-NC,随后诱导细胞分化48 h进行免疫荧光试验。试验步骤如下:用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞2次,然后用4%多聚甲醛固定15 min;随后用PBS洗涤细胞2次,用0.25% Triton X-100室温下孵育10 min;加封闭液(3%牛血清白蛋白、0.3% TritonX-100、10%胎牛血清)室温孵育2 h;一抗孵育4 ℃过夜(抗体信息见表1);PBS洗涤细胞3次,然后进行二抗孵育,室温2 h;PBS洗涤细胞3次,然后用4′,6-Diamidino-2-Phenylindole(DAPI)进行细胞核染色;最后使用Axio Observer倒置显微镜系统获取图像。

表1 免疫荧光和蛋白质免疫印迹所用抗体Table 1 Antibodies used for immunofluorescence and Western blot

1.4.4 蛋白质免疫印迹(Western blot, WB)检测 使用哺乳动物蛋白提取试剂获得约106个细胞的蛋白裂解液。采用双板垂直电泳仪分离蛋白质并将蛋白质转移到硝酸纤维膜上。分别用一抗(抗体信息见表1)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育,进行免疫印迹。使用Tanon 5200多成像系统检测ECL化学发光HRP底物(WBKLS0500)产生的信号。

1.4.5 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测 利用Trizol法从约105个细胞中提取总RNA。使用Prime ScriptTM RT试剂盒进行反转录,启动cDNA合成。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix进行qRT-PCR,结果采用ABI QuantStudio 6实时荧光定量PCR系统进行监测,引物信息见表2。每个处理组包含3个生物重复,每个生物学重复包含3个样本,以β-Tubulin为内参。所有结果均用“平均值±s.e.m.”表示,采用不配对的t-检验来确定差异统计学意义,P<0.05或P<0.01表示差异显著。

表2 qRT-PCR引物信息Table 2 Table of qRT-PCR primers information

1.4.6 DIA定量蛋白质组学测序及分析(DIA-seq) DIA-seq由基迪奥生物技术有限公司(中国,广州)完成,每个处理组包含3个生物学重复。首先,用裂解缓冲液(含1% SDS、8 mol·L-1尿素和1 mg·mL-1蛋白酶抑制剂)提取蛋白,然后进行蛋白质量检测和酶解。随后进行质谱预处理,根据试验需求选择合适的除盐柱进行除盐,取适量样品,选用皮尔斯定量比色肽测定试剂盒(PierceTMQuantitative Colorimetric Peptide Assay, Thermofisher, 23275)进行肽段定量,计算肽段总量并抽干。建立谱图数据库,将肽混合物重新溶解在缓冲液A中(20 mmol·L-1甲酸铵,用氢氧化铵调pH至10.0),然后使用Ultimate 3000系统进行高PH反相分离。将除盐冻干后的肽段重溶于Solvent A(0.1% 甲酸水溶液)后经由配备在线纳喷离子源的 LCMS/MS分析。整套系统为串联 EASY-nLC 1200 系统的 Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪,在数据依赖采集模式下运行,在MS和MS/MS采集间自动切换。质谱参数设置为:MS:扫描范围 (m/z):350～1 500,分辨率:120 000;AGC target:4×105,最大注入时间:50 ms;动态排除时间:30 s;HCD-MS/MS:分辨率:15 000;AGC target:5×104,最大注入时间:35 ms;碰撞能量:32。原始数据通过Spectronaut X (Biognosys AG)合并分析搜库,采用软件默认的参数建库。数据库使用 Uniprot或提供的数据库,设置 Trypsin酶解。搜库参数固定修饰:Carbamidomethyl (C),可变修饰:methionine氧化。母离子和肽段水平的假阳性率(FDR)都设置为1%。采用 Spectronaut 对DIA数据进行蛋白组学的鉴定、定量及差异蛋白分析、富集分析等。蛋白质定性标准:Precursor Threshold 1% FDR,Protein Threshold 1% FDR。Decoy数据库采用mutated策略生成,Spectronaut进行自动校正,所有符合筛选条件的MS1都用来计算表达量。筛选 FDR小于1%的前3个MS1肽段的峰面积平均值进行蛋白质定量。蛋白互作分析采用STRING数据库和Cytoscape作图软件,GSEA分析采用Broad Institute研究所开发的GSEA分析软件和MSigDB基因集数据库。

2 结 果

2.1 MMP14调控卫星细胞成肌分化

为了研究MMP14在卫星细胞分化过程中的作用机制,采集了4周龄小鼠的后腿骨骼肌进行卫星细胞的分离和培养,并应用qRT-PCR和Western blo试验检测MMP14基因在卫星细胞(GM)和分化期(DM,诱导24 h)的表达水平。试验结果表明,MMP14基因的mRNA和蛋白水平均在卫星细胞分化期下调(图1A&1B)。进一步应用RNAi技术抑制MMP14蛋白表达(图1C),并通过qRT-PCR和免疫荧光试验检测MMP14对卫星细胞分化能力的影响。结果表明,试验组(si-MMP14)与对照组(si-NC)相比,分化标志基因MYOG、MYHC和MCK的表达量显著下调,肌管数量和融合指数下降(图1D&1E),表明抑制MMP14可以有效抑制卫星细胞肌源性分化。

A.qRT-PCR检测卫星细胞增殖期(GM)和分化期(DM,24 h)MMP14基因的mRNA水平。B.Western blot检测卫星细胞增殖期(GM)和分化期(DM)MMP14蛋白表达水平。C.Western blot检测si-MMP14干扰效果,柱状图为条带灰度值分析。D&E. 在卫星细胞中转染si-MMP14,诱导细胞分化48 h:D.通过qRT-PCR检测分化标志基因表达水平;E.利用免疫荧光试验检测肌管(Myosin,红光),细胞核用DAPI染色(蓝光),标尺为100 μm。qRT-PCR试验中每组设3个生物学重复,试验数据以“均值±标准差”的形式呈现,*. P<0.05,**. P<0.01。Western blot试验和qRT-PCR均以β-Tubulin为内参A. qRT-PCR was performed to detect the expression level of MMP14 gene in satellite cells in proliferation and differentiation status. B. Western blot analysis was performed to detect the expression level of MMP14 protein in satellite cells in proliferation and differentiation status. C. Western blot analysis was performed to detect interference effect of si-MMP14. The gray value analysis of the bands was represented by a bar chart. D&E. si-MMP14 was transfected into satellite cells, and the cells were then induced to differentiate for 48 h: The expression level of differentiation marker genes was detected by qRT-PCR (D), and myotubes (Myosin, red) were detected by immunofluorescence assay (E). Nucleus was stained with DAPI (blue) scale bars: 100 μm. β-Tubulin was used as the internal control. Triplicate samples were analyzed for each treatment, and the results were presented as the “mean±s.e.m”. *. P<0.05,**. P<0.01. β-Tubulin was used as the internal control in both Western blot and qRT-PCR图1 MMP14在卫星细胞肌源性分化过程中的功能Fig.1 Function of MMP14 in satellite cell myogenic differentiation

2.2 DIA-seq初步筛选卫星细胞中MMP14调控的蛋白

为了进一步研究MMP14蛋白调控卫星细胞发育的分子机制,通过si-RNA抑制卫星细胞中MMP14蛋白的表达,在卫星细胞增殖期收集细胞进行DIA定量蛋白质组学测序分析。经生物信息学分析发现,试验组(si-MMP14)与对照组(si-NC)相比,对照组数据的弥散程度更高(图2A),共筛选到549个差异蛋白,其中包括66个上调蛋白和483个下调蛋白(图2B&2C)。

A.小提琴图用来展示多组数据的分布状态以及概率密度,图形纵轴方向长度代表数据弥散程度,横轴方向长度代表在某纵坐标位置数据分布多少。B.红色柱子代表上调蛋白数,蓝色表示下调蛋白数。C.黄色圆点代表下调蛋白数,红色圆点表示上调蛋白数A. The violin chart is used to display the distribution status and probability density of multiple sets of data. The length along the vertical axis of the graph represents the degree of data dispersion, while the length along the horizontal axis represents the distribution of data at a certain vertical coordinate position. B. The red column represents the number of up-regulated proteins, while the blue column represents the number of down-regulated proteins. C. Yellow dots represent the number of down regulated proteins, while red dots represent the number of up regulated proteins图2 DIA-seq分析差异蛋白Fig.2 Differential proteins analysis using DIA-seq

2.3 差异蛋白功能注释和富集分析

本研究利用基因本体论(Gene Ontology,GO)对上述差异蛋白进行功能分析。对GO功能注释的3个本体进行统计发现,在生物学过程(biological process,BP)分析中,差异蛋白主要富集在细胞进程、单有机体过程、代谢过程等与肌肉细胞成分相关的生物学过程;在分子功能(molecular function,MF)分析中,差异蛋白主要富集在肌动蛋白结合、催化活性等分子信号传导相关的功能中;在细胞组成(cellular component,CC)分析中,差异蛋白主要富集在细胞构成、细胞器的构成以及细胞膜的完整性等与细胞骨架结构的完整性相关的组分(图3)。选取了生物学功能相关的前20个GO条目进行分析,发现差异蛋白主要富集在肌动蛋白的细胞骨架组织、染色质结构组成、染色质凝缩以及蛋白质的转运及翻译等过程(图4A)。

蓝色代表下调基因的蛋白数,红色代表上调基因的蛋白数Blue represents the number of proteins downregulated by genes, while red represents the number of proteins upregulated by genes图3 差异蛋白功能富集分析Fig.3 Functional enrichment analysis of differential proteins

A.差异蛋白GO分析;B.差异蛋白通路富集分析。气泡大小代表该条目所包含的蛋白数,气泡颜色代表该条目的富集显著程度A. GO analysis of differential proteins; B. Pathway analysis of differential proteins. The size of the bubble represents the number of proteins contained in each term, and the color of the bubble represents the significance of the enrichment of each term图4 差异蛋白GO分析和通路分析Fig.4 Pathway and GO analysis of differentially expressed proteins

为了探究MMP14在小鼠骨骼肌卫星细胞发育过程中的功能,进一步应用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)对蛋白质组学检测获得的差异蛋白进行通路分析(图4B)。结果表明,MMP14调控的蛋白富集在6 类通路中,包括有机系统,人类疾病,新陈代谢,环境信息过程、分子过程、基因信息过程。根据P值筛选出前20条信号通路,主要包括细胞黏附、细胞骨架调控通路、脂肪酸代谢、肌动蛋白骨架脂肪细胞因子氨基酸的生物合成等信号通路。

2.4 MMP14参与调控细胞命运决定以及H3-K9组蛋白修饰

本研究进一步对差异蛋白进行了基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)。结果表明,抑制MMP14会影响卫星细胞的细胞命运调控、肌细胞的分化以及H3-K9组蛋白修饰通路,但脂肪酸的生物合成通路显著上调(图5A-D)。基于GO、KEGG以及GSEA分析,对差异蛋白进行热图分析。结果表明,抑制MMP14蛋白的表达导致与成肌分化相关的蛋白显著上调,而与成脂分化以及H3-K9甲基化相关的蛋白显著下调。进一步说明MMP14参与调控卫星细胞分化以及细胞命运决定和异染色质结构等过程(图5E)。

A-D.差异蛋白GSEA分析。E.差异蛋白热图分析,红色代表上调基因,蓝色代表下调基因。F.差异蛋白互作网络分析。G.Western blot检测肌源性决定因子(PAX7和MYOD)、脂肪分化决定因子(JUN和C/EBPβ)以及H3-K9组蛋白甲基转移酶(SETDB1和SUV39H1)的表达水平,β-Tubulin作为内参蛋白A-D. GSEA analysis of differential proteins. E. Heat map of differential proteins. Red represents up-regulated genes, blue represents down-regulated genes. F. Interaction network analysis of differential proteins. G. Western blot was performed to detect the expression level of myogenic determination factors (PAX7 and MYOD), lipogenic regulatory factors (JUN and C/EBPβ), and H3-K9 histone methyltransferase (SETDB1 and SUV39H1). β-Tubulin was used as the internal control图5 MMP14调控卫星细胞命运决定和异染色质结构Fig.5 MMP14 regulated satellite cell fate determination and heterochromatin structure

为了进一步分析MMP14调控卫星细胞分化的通路,应用STRING数据库中的互作关系分析工具对差异蛋白进行互作网络分析,并且利用Cytoscape构建互作关系网络图。互作分析结果表明,MMP14作为重要节点蛋白,与肌源性分化相关蛋白、脂肪生成相关蛋白以及异染色质结构调控蛋白直接互作(图5F)。进一步筛选关键蛋白并应用Western blot进行验证。结果表明,抑制MMP14蛋白可导致肌源性分化决定因子(MYOD和PAX7)以及H3-K9组蛋白甲基转移酶(SETDB1和SUV39H1)的表达水平明显下调,而成脂调控因子(JUN和C/EBPβ)的表达明显上调(图5G)。

3 讨 论

卫星细胞作为骨骼肌祖细胞,不仅可以分化为肌纤维,还可以调节细胞外基质的组成,从而影响骨骼肌发育[23]。骨骼肌的发育和再生依赖于卫星细胞肌源性特征的维持,如增殖、分化和自我更新的能力。Foster等[24]研究发现,卫星细胞一旦转入分化状态就会停止增殖,并伴随着细胞形态的改变,形成具有双极边缘的纺锤形,最后互相融合形成大的多核肌管。

本课题组前期的研究发现,随着骨骼肌发育卫星细胞的分化能力呈逐渐衰减的趋势。这个过程涉及到一系列胞内和胞外的调控因子,其中MMP14是关键调控因子之一。Lluri和Jaworski等[25]的研究表明MMP14的表达影响骨骼肌的生长。Christensen和Purslow[26]研究发现,在牛和小鼠的骨骼肌组织中MMP14均有表达,表明MMP14 参与肌管生成,可能是影响肌管形成的因素。本研究通过检测卫星细胞增殖期和分化期MMP14的表达水平,结果发现MMP14基因表达水平在小鼠骨骼肌卫星细胞增殖期显著上调,而在分化期下调。抑制MMP14蛋白表达可以有效地抑制卫星细胞分化,表明MMP14可以参与调控细胞分化,但这种调控作用可能发生在分化启动前而不是在细胞分化期。研究表明,许多功能基因虽然不直接参与终末端分化,但会在细胞分化启动前(迁移、激活或增殖期)发挥作用,进而影响后续肌源性效应因子表达和肌管融合等过程[27-29]。本研究进一步通过DIA定量蛋白质组学测序分析探究了MMP14调控卫星细胞分化的分子机制。通过对筛选到的差异蛋白进行互作网络分析发现,MMP14可与卫星细胞肌源性调控因子PAX7和MYOD蛋白直接互作。此外,抑制MMP14蛋白表达可导致PAX7和MYOD蛋白水平下调(图5G)。PAX7和MYOD的表达在骨骼肌卫星细胞的活化、增殖和分化中起重要作用,PAX7和MYOD的表达增加表明卫星细胞在高度增殖[30]。PAX7是卫星细胞的标志蛋白,它的表达缺失会导致卫星细胞数量减少以及MYOD蛋白表达水平下调,卫星细胞肌源性分化潜力下降[31]。MYOD是骨骼肌特异性转录因子,在卫星细胞分化启动过程中发挥重要作用,可在分化启动时瞬时高表达,进而上调下游MRFs家族基因表达水平,从而促进卫星细胞分化[32-33]。因此推测,MMP14可能通过调节PAX7和MYOD的表达影响卫星细胞的肌源性潜能和分化启动,进而影响卫星细胞的成肌分化。当细胞进入分化进程后MMP14蛋白水平下调,表明MMP14对卫星细胞肌源性分化的调控作用发生在分化启动前,而不是直接参与调控分化启动后的肌源性效应因子的表达和肌管融合。

在本研究中,蛋白组学分析共筛选得到549个差异蛋白,通过对这些差异蛋白进行GO、KEGG以及GSEA分析,发现MMP14可参与调控细胞黏附、脂肪酸代谢通路、细胞命运决定以及染色质结构等生物学过程和通路。蛋白互作分析表明,除了肌源性调控因子PAX7[11-13]和MYOD之外,MMP14还与成脂调控因子(JUN和C/EBPβ)以及H3-K9组蛋白甲基转移酶(SETDB1和SUV39H1)直接互作。抑制MMP14蛋白可下调SETDB1和SUV39H1蛋白表达水平,上调JUN和C/EBPβ蛋白表达水平(图5)。JUN又名活化蛋白1(AP-1),是一种转录复合物。Lee等[34]对JUN作为转录因子在脂肪细胞分化中的作用进行研究,结果发现小鼠3T3-L1前脂肪细胞中JUN过表达显著抑制脂肪细胞分化。C/EBPβ是CCAAT/增强子结合蛋白的成员,是促进脂肪形成的主要转录因子之一[35]。Zhao等[36]的研究证明,敲除C/EBPβ会减少棕榈酸处理的HepG2细胞中的脂质积聚并增加脂解。H3-K9组蛋白位于细胞核外源,是一种与转录沉默相关的组蛋白[37]。H3-K9me2/3是异染色质区的表观遗传标志,标记表达沉默的基因,优先富集在染色体的基因贫乏区域,形成转录抑制的异染色质区,而相关基因在异染色质区的分布会影响基因的表达[38-39]。McCarthy等[40-41]的研究表明,H3K9me2/3的标志性蛋白异染色质蛋白1 (HP1)与H3-K9组蛋白甲基转移酶(Setdb1、SUV39H1)相互作用,影响SETDB1和SUV39H1蛋白的稳定性。Ambrosio等[42]的研究发现,H3-K9me2/3的甲基化水平在增殖的卫星细胞中表达较高,可以调控MyoD因子的表达。在成肌细胞的增殖阶段,H3-K9组蛋白甲基转移酶SUV39H1与MyoD相互作用募集H3-K9me2/3抑制标记,从而抑制卫星细胞的分化[43]。因此推测,MMP14可以通过调控H3-K9组蛋白的甲基化来影响异染色质区域结构,并且直接与成肌和成脂关键调控因子互作,参与调控卫星细胞分化和命运决定。

4 结 论

本研究初步分析了MMP14调控骨骼肌卫星细胞分化机制。研究发现,MMP14调控卫星细胞的肌源性潜能和启动分化前的细胞状态,进一步影响细胞分化和肌纤维发育过程,而不是直接参与卫星细胞的终末端分化。此外MMP14可能通过H3-K9组蛋白甲基化参与卫星细胞命运决定以及成肌与成脂分化的转换。本研究结果将为金属基质蛋白酶参与调控骨骼肌发育的分子机制提供理论依据。