常山口服液治疗鸡球虫病的效果分析

罗晓琴,郭志廷,王 贺,张景艳,张 康,王 磊,马永华,李建喜,*

(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业农村部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州 730050)

鸡球虫病是一种严重危害家禽养殖的肠道寄生虫病。鸡球虫在国内外公认的有7个种,其中,柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球虫的感染性比较强[1]。临床上往往是几种球虫的混合感染,感染后引起鸡肠道组织损伤,导致消化功能紊乱、脱水、失血并继发感染细菌性疾病[2-3]。以往抗生素和化学合成抗球虫药物是防治鸡球虫病的主要途径,随着球虫耐药性和药物残留的日趋严重,以及绿色健康养殖的逐步实施,迫切需要研发新型抗球虫药物[4-5]。

中药常山为虎耳草科植物的干燥根,别名黄常山、鸡骨常山、鸡骨风、风骨木等,分布于陕西、湖南、甘肃、安徽、湖北等地[6-8]。《本草纲目》中记载:“常山有截痰截疟之功”,在民间主要用于治疗疟疾。现代研究表明,常山具有抗疟疾、抗球虫、抗肿瘤、抗瘢痕等广泛的药理活性[9]。利用现代中药提取分离技术,从中药常山中将有效成分常山碱充分提取出来,制成常山口服液,并用于防治鸡球虫病。依据农业农村部第1596号公告《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》和第2337号公告《兽药临床试验质量管理规范》的相关规定,开展试验感染鸡治疗效果和临床病例治疗效果的分析,旨在验证常山口服液的抗球虫疗效、最佳给药剂量和给药时间,为今后申报新兽药和防治鸡球虫病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物

常山口服液中试产品(500 mL·瓶-1,批号15090501),石家庄正道动物药业有限公司生产,推荐剂量是5 mL·L-1饮水给药。百球清(妥曲珠利溶液,含量2.5%)为对照药物,购自拜耳(四川)动物保健有限公司,按1 mL·L-1饮水给药。

1.2 试验虫株

柔嫩艾美耳球虫广东株(1996年分离自广东花都),由中国农业科学院兰州兽医研究所禽病研究室保存和提供[10]。

1.3 试验动物和饲料

1日龄AA黄羽肉鸡,购自兰州市某种鸡场,饲养于无鸡球虫污染笼舍内;饲料为肉小鸡全价料,不含任何抗球虫药物,购自兰州养动力饲料有限公司。

1.4 试验感染鸡治疗效果分析

1.4.1 动物分组与处理 1日龄健康雏鸡,在无球虫感染条件下饲养至16日龄,随机分为6组,包括健康对照组、感染对照组、妥曲珠利对照组、常山口服液低中高剂量组,每组20只鸡。除健康对照组外,其余各组每只鸡经口感染6×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(攻虫前2个月健康雏鸡复壮,以保证虫株感染活力),攻虫24 h后开始给药,每天观察各组试验鸡的精神状态、饮食饮水和血便情况。如有死亡鸡,应及时进行解剖,观察各脏器病理变化。具体分组与处理见表1。

1.4.2 抗球虫效果评判标准 试验前(16日龄)和试验结束(24日龄),每组鸡称重,计算平均增重。试验结束(24日龄)全部捕杀,收集盲肠,纵向剪开后对每对盲肠按Johnson与Reid(1970)的方法进行病变计分,收集盲肠内容物进行球虫卵囊计数。根据各组试验鸡的相对增重率、存活率、病变值和卵囊值,按照美国Merck公司的计算公式,计算抗球虫指数(ACI)[11-13]。

ACI=(相对增重率+存活率)×100 -(病变值+卵囊值)

以ACI来判定药效:ACI<120 为无效;ACI=120～160为低效;ACI=160～180为良好;ACI>180为高效。

1.5 临床病例治疗效果分析

1.5.1 动物分组和处理 选取自然感染球虫的病鸡开展本试验。经流行病学调查、临床诊断、死亡鸡剖解、粪便中球虫卵囊检查诊断为鸡球虫病。所有病例的畜主均同意参加试验并按照本方案进行治疗。依据常山口服液抗球虫预试验结果,确定其临床推荐剂量为5 mL·L-1饮水[14],具体分组与处理见表2。

表2 试验鸡分组与处理Table 2 Grouping and treatment of the chick

1.5.2 疗效判定 根据以下标准进行判定。

治愈:用药后临床症状消失,血便停止,精神及采食量恢复正常,7 d后粪检无卵囊,判为治愈,每组治愈鸡数占每组试验鸡总数的百分率为治愈率。

有效:用药后临床症状减轻,血便减少,精神及采食量基本恢复正常判为有效,每组治愈鸡数加上有效数占每组试验鸡总数的百分率为有效率。

无效:用药后临床症状未见任何减轻,血便没有减少,甚至加重或死亡,判为无效。

1.5.3 组织病理学检查 试验结束后,常山口服液组、妥曲珠利组和感染对照组经尸体解剖学检查的部分试验鸡,采集盲肠,10%甲醛溶液固定,制作石蜡组织切片,HE染色,观察组织病理学变化,在显微镜下观察鸡盲肠上皮细胞形态变化、炎症细胞浸润等情况,并和健康对照组进行比较。

2 结 果

2.1 试验感染鸡治疗效果分析

2.1.1 临床症状 结果显示,感染对照组试验鸡攻虫后4～5 d,开始出现临床症状,包括精神不振、饮食欲减退、羽毛蓬乱,病鸡排出血便。但常山口服液中、高剂量组和妥曲珠利对照组试验鸡临床症状明显减轻或消失,无血便排出。健康对照组试验鸡精神状态和饮食均正常。

2.1.2 盲肠剖解变化 结果显示,感染对照组试验鸡盲肠明显肿胀,内容物中血液较多。常山口服液中、高剂量组和妥曲珠利对照组试验鸡盲肠肿胀明显减轻,内容物中血液明显减少。健康对照组试验鸡盲肠无肿胀和内容物无血液(图1)。

A. 健康对照组;B. 感染对照组;C. 妥曲珠利组;D. 常山口服液低剂量组;E. 常山口服液中剂量组;F. 常山口服液高剂量组A. Healthy control group; B. Infection control group; C. Toltrazuril group; D. Low dose CSL group; E. Medium dose CSL group; F. High dose CSL group图1 试验鸡盲肠病理变化Fig.1 Pathological changes of chicken cecum

2.1.3 抗球虫效果 结果显示,常山口服液中、高剂量组试验鸡的相对增重率(101.6%和119.8%)和存活率(100%)均高于妥曲珠利组和攻虫不给药组。但妥曲珠利组试验鸡的病变值(22.5)和卵囊值(10)均低于常山口服液各剂量组。通过相对增重率、存活率、病便值和卵囊值计算抗球虫指数,结果表明,常山口服液中、高剂量组抗球虫指数分别为166.6和173.8(表3和4)。

表3 相对增重率(n=20)Table 3 Relative weight gain rate (n=20)

表4 抗球虫指数Table 4 Anticoccidial index

2.2 临床病例治疗效果分析

2.2.1 病例纳入情况 试验鸡品种:清远麻鸡,存栏量:20 000羽,试验地点:云南省石林县板桥。临床症状:51日龄鸡群有血便,剖检盲肠内有血液,小肠有点状出血,肠管充气肿胀,51日龄开始每天死亡10～20只。实验室检查:病鸡粪便中检出大量鸡球虫卵囊(图2)。

A.病鸡排出血便;B.病鸡盲肠肿胀;C.粪便中检出球虫卵囊A. Bloody excrement; B. Swelling cecum; C. Coccidium oocysts in the excrement图2 临床症状、剖解变化和实验室检查结果Fig.2 Clinical signs, anatomical changes and laboratory determination

2.2.2 临床病例治疗效果分析 参照鸡球虫病诊断标准,将“2.2.1”中发病初期的病鸡随机挑出1 000只(51日龄),开展本试验,试验分组和处置见表2。结果表明,常山口服液和妥曲珠利给药后第1天,试验组鸡每天死亡2～3只;给药后第2天,试验组鸡死亡停止,血便明显减少,采食量提升;给药后第3天,试验鸡血便排出停止;给药后第4天,病鸡临床表现基本恢复正常。空白对照组病鸡死亡数随时间呈上升趋势。具体治疗结果见表5。

表5 常山口服液治疗结果Table 5 Therapeutic effect of CSL

2.2.3 盲肠组织病理学结果 结果表明,健康对照组鸡盲肠结构完整,盲肠上皮细胞形态良好,可见大量杯状细胞。感染对照组鸡盲肠肌肉厚度和隐窝深度增加,盲肠上皮细胞内可见较多球虫配子或卵囊,组织内有大量炎性细胞和红细胞浸润,杯状细胞明显减少。常山口服液组和妥曲珠利组鸡盲肠结构基本完整,隐窝深度、肌层和浆膜厚度与健康组比较增加不明显,杯状细胞数量减少(图3)。

A. 健康对照组;B. 感染对照组;C. 常山口服液组;D. 妥曲珠利组A. Healthy control group; B. Infection control group; C. CSL group; D. Toltrazuril group图3 鸡盲肠组织病理学变化(100×)Fig.3 Histopathological changes of chick cecum (100×)

3 讨 论

随着现代肉鸡养殖业规模化、集约化的快速发展,球虫病的危害也日益加重,其中柔嫩、堆型、巨型艾美耳球虫危害最为严重。球虫病的暴发会导致鸡生长受阻、饲料转化率降低和肉蛋品质下降,全世界每年由于该病造成的经济损失高达30亿元[15-16]。目前鸡球虫病的防治主要依靠化学合成药物(如妥曲珠利、地克珠利、常山酮、磺胺类药等),以上药物的使用降低了鸡球虫病的危害,但也引起耐药虫株的不断出现,同时药物残留导致的食品安全问题也引起了人们的高度关注[17-18]。

中药防治鸡球虫病的作用机理与西药不同,西药是直接抑杀球虫,而对于球虫引起患病鸡肠道损伤和全身临床症状无明显的治疗作用,而中药是依据中兽医药理论,在对球虫病辩证的基础上进行合理组方,不仅可以有效抑杀球虫,还能修复损伤的肠道,减轻临床症状[19-20]。结果表明,中药复方(由常山、槟榔、地榆、黄芩等组成)高、中剂量对鸡球虫病有良好的预防效果,抗球虫指数分别为 183.01、183.83[21]。自拟方剂(由青蒿、常山、仙鹤草和地榆组成)同样对鸡球虫病有良好的治疗效果,抗球虫指数为170.41,且能有效改善球虫病鸡受损的盲肠组织,加快其肠道功能恢复[22]。常山红藤汤(由常山、红藤、白头翁、柴胡等组成)对兔球虫病有较好的治疗效果,给药组病兔临床表现、肠道病变值、每克粪便卵囊数均明显低于阳性对照组,平均增重明显高于阳性对照组[23]。

常山具有良好的抗球虫效果,主要有效成分为常山碱甲和乙;但目前国内外对于常山碱的分离纯化、抗球虫作用及机理研究甚少。养鸡生产中有直接应用常山原粉的防治方法,但鸡不能很好地消化纤维素,导致常山碱不能被充分吸收利用,抗球虫效果大幅降低[24-25]。本课题组利用现代中药提取分离技术,将常山碱从中药常山中充分提取出来,制成口服液制剂,具有易吸收、起效快和疗效好的特点,便于现代规模化养鸡场临床给药,更好发挥抗球虫作用[26]。

本试验结果表明,常山口服液中、高剂量组具有良好的抗球虫效果,抗球虫指数分别为166.6和173.8;且药物对试验鸡具有较好的促生长效果(相对增重率为101.6%、119.8%)。在临床实践中,鸡球虫病多是几种球虫混合感染,如柔嫩艾美耳、毒害艾美耳混合引起的球虫病,临床上病鸡排出番茄样粪便或血便,剖解盲肠和十二指肠均有出血点。临床病例治疗效果分析表明,常山口服液以5.0 mL·L-1饮水给药,连续给药4 d,可有效治疗自然感染球虫的病鸡,治愈率和有效率分别为80.7%和96.7%;病鸡一般给药3 d即可治愈,为了巩固疗效,临床上多给药1 d,共计4 d,取得了良好的防治效果,后期随访无复发。组织病理学结果发现,感染对照组鸡盲肠上皮细胞内可见较多球虫配子或卵囊,组织内有大量炎性细胞和红细胞浸润。但常山口服液组和妥曲珠利组鸡盲肠结构基本完整,隐窝深度、肌层和浆膜厚度基本正常。

综合分析以上试验结果,发现常山口服液和妥曲珠利防治鸡球虫病各有所长,前者在促增重方面略胜一筹,这可能和其能够提高机体免疫力有关[27];后者在减轻鸡盲肠病变和减少球虫卵囊方面效果较好(病变值和卵囊值分别为22.5和10.0)。但妥曲珠利是化学合成药物,在临床上使用已有几十年,临床上耐药性和药物残留比较严重,本试验中抗球虫指数为154.4,可能和其产生耐药性有关。

4 结 论

常山口服液按照5.0 mL·L-1饮水给药,连用4 d,对人工感染和自然感染的鸡球虫病有较好的治疗效果和促增重作用。常山口服液作为一类纯中药制剂,具有绿色环保、抗球虫疗效好等特点,为进一步研发新药提供了重要的数据支撑。