经典方剂当归地黄饮治疗月经后期的网络药理学作用机制研究

张多加,袁温鲜,卢利歌,李 杨,杨新鸣,马丽娜,吴效科

(1. 黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2. 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3. 山东中医药大学附属医院,山东 济南 250014;4. 山东中医药大学博士后流动站,山东 济南 250014)

月经后期是临床常见月经病之一,其首见于《金匮要略》,称为“至期不来”,唐代《备急千金要方》称为“隔月不来”“两月三月一来”,明代缪希雍《先醒斋医学广笔记》称本病为“经行后期”,形象生动地表述出本病之病症特点,明代张景岳《景岳全书》称本病为“经迟”[1]。月经后期之病因病机较为复杂,或因精血不足,或因邪气阻滞;其病或在气血,或在脏腑[2]。妇人以肝肾为本,一者藏血,一者藏精,正如《傅青主女科》云:“经本于肾”、“经水出诸肾……经原非血,乃天一之水,出自肾中。”月经的产生与肾、肝、冲任等关系密切相关。肾所藏之精能生血,肝所藏之血可化精,两者相互滋生,故称“肝肾同源”,也称“精血同源”,精血为月经生成之本,精血充足则经水自足。肾所藏阴精充沛,则化生气血涵养肝,则精能化血以养肝,水能涵木,肝气疏泄功能正常,则气机调畅,气血和调,则无亢害横逆之弊。肾精亏损致肾气不足,肝气疏泄功能失常,冲任气机失畅,血行迟滞,可致月经后期。肾所藏之精能生血,肝所藏之血可化精,若肝藏血不足,无法下输涵养肾并化精贮藏在肾脏,则精亏血少,冲任血虚,血海不按时满溢,可致月经后期、月经过少等疾病,甚至闭经、不孕。

当归地黄饮出自明代张介宾所著《景岳全书·卷 五十一》,方用当归二、三钱,熟地三、五钱,山药二钱,杜仲二钱,牛膝一钱半,山茱萸一钱,炙甘草八分,全方仅七味药[3]。当归地黄饮以祖国医学“精血同源”理论为依据,以滋补肝肾法为切入点。方中当归性甘辛温,补阴摄阳,使阴得阳助而运化无穷,为养血补血要药;熟地黄入肝肾经,补肾养血、填髓益精;当归与熟地黄合而为君,可养阴补肾、填精养血;山茱萸可滋补肝肾、益气血,与山药协同发挥固肾、益精等功效;杜仲入肝肾经,以补肝肾、固冲任见长,可标本兼治;牛膝活血调经止痛,使补而不滞;蜜炙甘草既调和诸药,又健脾益气和中[4];诸药合用共奏补肾助阳、养血调经之功。全国中医药行业高等教育“十四五”规划教材《中医妇科学》[5]以当归地黄饮治疗月经后期之肾虚证。临床上应用当归地黄饮可明显缩短月经后期患者月经周期,增加经量[6-7]。

现代药理研究表明当归地黄饮治疗月经后期的作用机制主要体现在两方面:①滋补肾阴的中药可提高性腺受体的功能,调节下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA),调节卵巢功能,以达到理想的治疗效果;②可能通过抗颗粒细胞凋亡促进卵母细胞发育与成熟,作用于多系统、多环节,对机体状态起到良好的调节作用[8]。本文将通过网络药理学的数据分析实现药物与疾病相互作用的可视化,再通过分子对接模拟分子间的相互作用来预测其结合模式和亲合力[9],以此分析当归地黄饮治疗月经后期的主要活性成分、主要的生物学过程、介导的信号通路等,以预测可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1当归地黄饮活性成分的筛选及其作用靶点的获取 通过中药系统药理分析平台——TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[10],查找当归地黄饮的成分,并根据药动学参数筛选,以口服生物利用度≥30%、药物相似性≥0.18为筛选标准,分别以“当归、熟地黄、山茱萸、山药、杜仲、怀牛膝、甘草”为关键词,筛选获得当归地黄饮七味中药的主要化学成分,并通过Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)[11]得到对应靶点的基因号及标准化命名。

1.2月经后期疾病靶点的获取与筛选 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)[12]、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)[13]、OMIM数据库(https://omim.org/)[14]中以“late menstruation(月经后期)”“delayed menstruation(月经延迟)”“rare menstruation(月经稀发)”等作为关键词搜索月经后期的潜在靶点,最后汇总并删除重复项得到月经后期潜在靶点。

1.3当归地黄饮治疗月经后期网络的构建 通过venny2.1.0平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取当归地黄饮各药物成分对应的基因靶点与月经后期疾病共同靶点,绘制韦恩图,利用软件Cytoscape 3.9.0(https://cytoscape.org/)[15]构建当归地黄饮的“药物-活性成分-靶点”网络,通过连接度中心性(degree centrality,DC)、紧密度中心性(closeness centrality,CC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)等网络拓扑参数筛选出较为重要的活性成分与靶点及两者之间的关系。

1.4当归地黄饮治疗月经后期的共同靶点筛选及蛋白互作网络构建 将交集靶点信息输入STRING 11.5数据库(https://cn.string-db.org/)[16],构建可视化的蛋白互作PPI 网络。然后,利用Cytoscape 3.9.0软件,根据DC、BC、CC筛选出PPI网络的关键靶点。

1.5GO分析与KEGG通路富集分析 运用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[17]对交集靶点作进行GO富集分析及KEGG通路分析。以P<0.05作为条件进行筛选,将前10条基因生物过程和信号通路利用在线工具将富集的通路进行高级气泡图的可视化分析,利用KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/)对代表性通路进行具体可视化分析。

1.6分子对接 利用分子对接技术,对上述网络药理学分析进行进一步验证。利用TCMSP数据库下载得到药物核心成分的3D结构信息,下载其作为配体小分子的mol2格式;在 RCSB PDB 数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)中获取核心靶点的pdb格式结构,利用PyMOL 2.2.0软件对靶蛋白进行去水、去配体等前处理,然后利用AutoDockTools 1.5.7软件对配体小分子、靶蛋白进行加氢、加电荷等操作,再利用Autogrid模块设置对接区域、对接位点等参数,并利用Docking模块对靶蛋白与配体小分子进行分子对接,并分析计算能量,将最优对接结果保存为PDBQT格式。最后利用PyMOL软件对潜在核心成分与核心靶点进行可视化处理。

2 结 果

2.1当归地黄饮的有效成分及靶点 通过TCMSP数据库初步检索得到当归地黄饮的主要化学成分共180个,其中当归2个,熟地黄2个,山茱萸20个,山药16个,杜仲28个,怀牛膝20个,甘草92个,合并删除重复项后共得到有效成分166个,主要成分见表1。使用TCMSP数据库初步检索得到当归地黄饮的作用靶点共3 130个(当归69个、熟地黄34个、山茱萸130个、山药144个、杜仲545个、怀牛膝444个、甘草1 764个),合并后删除重复靶点基因后得到作用靶点283个。通过Uniprot数据库得到规范化蛋白质靶点275个。

表1 当归地黄饮有效成分

2.2月经后期的疾病靶点 通过GeneCards 、DrugBank、OMIM数据库检索初步得到月经后期相关的疾病靶点共1 509个,删除重复值后得到1 484个。

2.3当归地黄饮治疗月经后期网络的形成 共得到当归地黄饮与月经后期共同作用靶点128个,绘制韦恩图,见图1。利用Cytoscape软件绘制当归地黄饮“药物-活性成分-靶点”网络,见图2。该网络共计3 259条边,429个节点:包括方名(紫色八边形表示),7个药名(紫色菱形表示)、6个药物共同成分(粉色菱形表示),141个药物成分(绿色圆形表示,其中山茱萸11个、山药11个、杜仲22个、牛膝13个、甘草84个),275个基因靶点(绿色方形表示)。依据各节点Degree和BC值的筛选,结果显示:stigmasterol(豆甾醇)、quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、naringenin(柚皮素)及formononetin(芒柄花黄素)等化合物可能是当归地黄饮治疗月经后期的核心成分,PTGS2、NCOA2、F7、HSP90AA1、PTGS1、PPARG、AR及ESR1可能是当归地黄饮治疗月经后期的核心靶点。

图1 当归地黄饮靶点与月经后期靶点韦恩图

注:DGDHY为当归地黄饮;Drug1为当归;Drug2为熟地;Drug3为山茱萸;Drug4为山药;Drug5为杜仲;Drug6为牛膝;Drug7为甘草;R1为豆甾醇;R2为β-谷甾醇;R3为谷甾醇;R4为槲皮素;R5为山柰酚;R6为迈林

2.4当归地黄饮治疗月经后期的共同靶点筛选及互作网络构建 将交集靶点导入STRING平台进行PPI 网络图构建,经筛选得到每个条件均高于中位值的靶点,见图3。结果显示:ALB、Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA可能是当归地黄饮治疗月经后期的重要靶点。

图3 当归地黄饮治疗月经后期PPI网络图

2.5GO分析与KEGG通路富集分析结果 将当归地黄饮治疗月经后期的交集靶点导入David数据库收集GO功能富集数据,以P<0.05为条件收集到生物学过程(biological process, BP) 618个条目、细胞组分(cellular component,CC) 78个条目、分子功能(molecular function,MF)118个条目。分别选取BP、CC、MF结果中P值最小的10条结果进行富集分析,绘制GO富集条形图,见图4。BP包括对RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、细胞凋亡过程的负调控、对外源性刺激的反应、蛋白质磷酸化的正调控等;CC方面主要是质膜、细胞外间隙、膜的组成部分、细胞外区、大分子复合物等;在MF上着重于蛋白质结合、相同蛋白质结合、酶结合、泛素蛋白连接酶结合、血红素结合等。KEGG分析共获得183条通路,与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症途径、脂质与动脉粥样硬化、前列腺癌症、IL-17信号通路(图5)。其中IL-17信号通路(图6)与TNF信号通路可能是主要信号通路。

图4 当归地黄饮核心靶点GO条形图

图5 当归地黄饮核心靶点KEGG气泡图

图6 IL-17信号通路

2.6分子对接结果分析 通过对核心靶点ALB、Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA分别与及核心成分stigmasterol、quercetin、kaempferol、beta-sitosterol、naringenin、formononeti-n进行两两对接,结果表明:当归地黄饮治疗月经后期的有效成分均与核心靶标具有良好的结合性。通过热力图展示各组数据(图7)。将能量最低的6组对接结果用PyMol软件绘图,见图8。

图7 当归地黄饮有效成分与核心靶点分子对接结合能热图(kcal/mol)

注:a为TNF与stigmasterol;b为VEGFA与stigmasterol;c为VEGFA与β-sitosterol;d为VEGFA与formononetin;e为AKT1与β-sitosterol;f为AKT1与formononetin

3 讨 论

本研究通过TCMSP数据库筛选出当归地黄饮166个有效成分,通过药物-靶点网络图筛选发现豆甾醇、槲皮素、山柰酚可能是当归地黄饮治疗月经后期的主要活性成分。豆甾醇是一种植物雌激素,与雌激素、内分泌抵抗和甲状腺激素等信号通路相关[18]。槲皮素是一种抗细胞凋亡和抗炎化合物,研究发现,在成熟培养液中添加槲皮素,可通过促进颗粒细胞免于凋亡,增加细胞间葡萄糖转运,帮助卵母细胞对抗外源性凋亡信号,从而提高卵母细胞的质量[19]。另有学者发现,槲皮素可显著降低睾酮、雌二醇、黄体生成素和肿瘤坏死因子-α的表达,上调卵泡刺激素和Bcl-2的表达,从而恢复卵母细胞成熟和排卵,缓解多囊卵巢综合征所致的激素、代谢及排卵异常[20]。山柰酚也是一种植物雌激素,现代药理学研究表明,植物雌激素可以进行双向调节,当体内雌激素水平低于正常水平时,可起到类雌激素作用,可防治女性更年期综合征、骨质疏松症等疾病。另一方面,当体内的雌激素水平高于正常水平时,如乳腺增生、子宫肌瘤等疾病,可产生雌激素拮抗作用,有效削弱靶细胞对雌激素的反应[21]。山柰酚也可促进卵母细胞减数分裂恢复,从而刺激卵泡发育[22]。

PPI网络结果显示,ALB、AKT1、IL6、TP53、TNF、VEGFA可能是当归地黄饮治疗月经后期的核心靶点。ALB基因编码人类血液中最丰富的蛋白质,可以调节血液的胶体渗透压,此外还有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等多种生理作用[23],而大量氧自由基被清除可改善卵巢卵泡微环境,修复卵巢功能,从而保障子宫内膜周期性增生、脱落,恢复正常的月经周期规律[24]。Akt1可调节各种细胞的生长、增殖、代谢、存活及血管生成等许多过程,其在卵母细胞、原始卵泡膜细胞、颗粒细胞及黄体细胞中均有表达[25],Akt1受损将导致卵泡生长发育以及成熟受阻,从而影响月经的正常来潮。在卵泡发育障碍的过程中,IL-6等多种炎症因子可作用于卵泡内外环境,从而影响卵泡形成、排卵以及黄体形成和撤退,并且可能引发卵泡闭锁,造成月经后期[26]。肿瘤相关蛋白TP53可直接或间接促使卵巢储备功能降低[27],研究发现,TP53基因突变可能通过脂质代谢、糖代谢及活性氧自由基的调控等方面,造成卵巢癌的发生[28]。VEGFA可促进新生血管形成和使血管通透性增加,研究表明,血管生成途径激活后,可促进卵巢血管的生成,减少颗粒细胞凋亡和卵泡的闭锁,促进卵丘扩张,增加线粒体活性,进而激发卵母细胞的发育潜能[29]。

通过KEGG富集分析,其中与月经后期密切相关的通路为IL-17与TNF信号通路。以上两种信号通路都是重要的炎症相关通路,近年来的研究表明,炎症过程与排卵有关,在卵巢卵泡动力学中起着关键作用[30]。白细胞介素家族及TNF等炎症因子在卵巢周期中卵泡生长发育的各个阶段起着重要的作用,可能主要依赖免疫系统调控HPO轴的相关激素分泌以促进卵泡发育、成熟与排卵[31]。学者研究发现,可以通过IL-17信号通路改善过氧化氢诱导的人卵巢颗粒细胞的凋亡[32]。IL-4、IL-6、IL-1B、 MMP1、MMP3都是富集在IL-17信号通路上的相关因子,该信号通路可以降解胞外 MMP1、MMP3,造成长期炎症,刺激子宫内膜从而导致部分子宫内膜出现病变[33]。此外,该通路上的MAPK1、MAPK3为排卵相关基因,主要参与卵泡发育中颗粒细胞的增殖调控。TNF-α也是一种重要的促排卵介质,在卵泡发育、类固醇生成、排卵、黄体溶解和闭锁中起作用,研究表明,TNF-α可减少卵母细胞的释放,并通过凋亡和自噬诱导未破裂卵泡颗粒细胞死亡,重塑卵巢组织[34]。

当配体小分子和受体蛋白的结合能≤-1.2 kcal/mol时说明对接良好,当归地黄饮各有效成分与核心靶点均对接良好,其中最稳定的是TNF、VEGFA与豆甾醇、VEGFA与β-谷甾醇对接。分子对接结果表明当归地黄饮活性成分与靶点分子结合稳定,具有治疗月经后期的作用。

综上所述,经典方剂当归地黄饮可能是通过调节雌激素水平、抵抗颗粒细胞凋亡、提高卵母细胞质量、促进卵泡发育等作用治疗月经后期。通过分子对接发现当归地黄饮的主要活性成分与月经后期疾病靶点有较好的结合活性,证明当归地黄饮治疗月经后期具有多靶点、多途径、多通路的特点,为当归地黄饮治疗月经后期的临床或基础研究提供初步依据,为临床治疗月经后期提供新的方向和思路。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。