基于药效学优化参花方提取工艺及其治疗银屑病的谱效关系研究

喻 琴,侯 岩,沈翠娥,李星子,陈中建,朱全刚

(上海市皮肤病医院/上海中药外用制剂创新工程技术研究中心,上海 200443)

参花方原名中浴1号,是上海市皮肤病医院中医科治疗银屑病等炎症性皮肤病的经验有效方,临床应用已逾10年[1-2]。该方由苦参、野菊花、生侧柏叶和花椒组成,具有清热解毒、除湿止痒的功效,针对银屑病“血分热毒炽盛,壅于肌表”的主要病因病机,有望成为治疗银屑病的潜在新药。目前,临床上使用的参花方制剂是水提制备的洗剂,本院正在积极将其开发制备为使用携带方便、稳定性更好的外洗颗粒剂。本课题组前期已经对参花方颗粒剂的安全性进行了系统评价,发现该制剂在临床使用浓度下安全、无毒,极具开发前景[3]。水提、醇提、水提醇沉为中药复方经典的提取方法,是影响复方药效的重要因素[4],但目前尚无研究对参花方提取工艺进行优化;此外,该方质量标准还不完善,其治疗银屑病的药效学物质基础也不清晰,这也阻碍了参花方的新药开发。近年来新药研究中鼓励以“疗效指标”而非传统指标“成分的含量”来评价提取工艺优劣[5]。药效学可以在动物整体水平上研究中药的作用效果及机制,较有效成分的比较更直观,相关性更显著[6]。谱效关系是在中药指纹图谱基础上,与药效进行有机的结合,旨在阐明中药发挥药效的物质基础[7-8],此类研究主要包括指纹图谱的获取、多指标药效检测和谱效关系建立。建立中药谱效关系,将其作为一种评价中药质量的方法,可以将中药化学成分与药效作用结合起来,更全面地反映中药质量,弥补中药质量评价体系的不足[9-11]。基于此,本研究依据药效学优化提取工艺的理念,比较参花方水提、醇提、水提醇沉提取物的药效,筛选最优提取工艺;并建立不同提取物的指纹图谱,采用灰色关联度分析,研究该方指纹图谱中共有峰(变量组)与抗银屑病作用(药效变量组)的谱效关系,阐明其抗银屑病作用的药效物质基础,为参花方质量评价体系的完善及新药开发提供参考。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级BALB/c小鼠42只,雄性,6～8周龄,体重(20±2)g,购自上海杰思捷实验动物有限公司,动物质量合格证号:20180004030036。动物饲养于上海市皮肤病医院动物房(温度22～26 ℃,相对湿度40%～65%)。本实验经上海市皮肤病医院伦理委员会批准,伦理批件号:2021-108(动)预。

1.2药物和试剂 苦参(Sophorae Flavescentis Radix,批号:19050702)、野菊花(Chrysanthemi Indici Flos,批号:19020202)、(生)侧柏叶(Cacumen Platycladi,批号:19041914)、花椒(Zanthoxyli Pericarpium,批号:19039801),药物均购自吴江上海蔡同德堂中药饮片有限公司,经该公司质量保证部检验,质量合格。对照药:他克莫司软膏(普特彼,规格:0.1%,批号:056350)。苦参碱对照品(批号:110805-201709)、槐定碱对照品(批号:110784-201706)、蒙花苷对照品(批号:111528-201911)购自中国食品药品检定研究院;绿原酸对照品(批号:17113021)、木犀草苷对照品(批号:18083022)购自上海同田生物技术股份有限公司;卡波姆941(批号:B30M9F57255)购自上海源叶生物科技有限公司;咪喹莫特乳膏(规格:3 g/150 mg,批号:40210802)购自四川明欣药业有限责任公司;三乙醇胺(批号:20191224 )、磷酸(批号:20200612)购自上海凌峰化学试剂有限公司;高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯,氯仿、乙醇等为分析纯,水为屈臣氏蒸馏水。

1.3参花方提取物的制备 ①水提物:按照处方配比称取复方各味药材,加6倍量水加热回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,滤过,合并滤液,加热浓缩后静置过夜,取上清液,继续浓缩适量即为水提物。②醇提物:按照处方配比称取复方各味药材,加6倍量70%乙醇加热回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,滤过,合并滤液,加热浓缩后静置过夜,取上清液,继续浓缩适量(无醇味)即为醇提物。③水提醇沉物:按照处方配比称取复方各味药材,加6倍量水加热回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,滤过,合并滤液,加热浓缩后添加乙醇至醇含量为70%,静置过夜,取上清继续浓缩适量(无醇味)即为水提醇沉物。

1.4干浸膏的制备 将以上3种提取工艺制备的提取物干燥,即得干浸膏,依据投料及产率计算生药比。

1.5凝胶剂的制备 将提取物制备成1%的卡波姆凝胶剂,外涂给药,以便进行药效学研究。制备方法:向上述3种提取物中加适量三乙醇胺调节pH至5～6,加适量卡波姆、纯化水,制备成终制剂生药比为25%的凝胶剂;按上述凝胶剂处方(不含饮片提取物),将三乙醇胺、水、卡波姆制备的空白凝胶剂作为阴性对照。

1.6HPLC指纹图谱建立方法

1.6.1对照品溶液的制备 取苦参碱、绿原酸、木犀草苷、蒙花苷对照品适量,精密称定,于同一10 mL的量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,即得混合对照品溶液:苦参碱118 μg/mL、绿原酸105.3 μg/mL、木樨草苷107.3 μg/mL、蒙花苷97 μg/mL。

1.6.2供试品溶液的制备 取不同提取物制备的各3批干浸膏1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称质量,超声处理45 min,冷却至室温,称质量,用甲醇补足失重,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,续滤液即为供试品溶液。

1.6.3色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),高效液相色谱仪为Waters e2695(美国Waters公司);以乙腈为流动相A、0.1%磷酸水为流动相B,进行梯度洗脱(0～20 min,5%A→15%A;20～50 min,15%A→30%A;50～65 min,30%A→50%A;65～70 min,50%A→60%A;70～80 min,60% A→85% A;80～90 min,85%A→95%A);流速为1 mL/min;柱温为30 ℃;检测波长为210 nm,进样量为20 μL。

1.6.4精密度考察 取水提干浸膏粉末,精密称定,按照“1.6.2”项下供试品溶液制备方法制样,按“1.6.3”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图。以苦参碱(即峰1,该峰分离度好、峰面积大且稳定)为参照峰(S),计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.4%,相对峰面积的RSD均小于5.3%,表明仪器精密度良好。

1.6.5稳定性考察 取水提干浸膏粉末,精密称定,按照“1.6.2”项下供试品溶液制备方法制样,室温下放置0,4,8,12,24 h后,按“1.6.3”项下色谱条件进样,记录色谱图。以1号峰苦参碱为参照,计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.4%,相对峰面积的RSD均小于6.0%,表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

1.6.6重复性考察 取水提干浸膏粉末6份,精密称定,按照“1.6.2”项下供试品溶液制备方法制样,按“1.6.3”项下色谱条件进样,记录色谱图。以1号峰苦参碱为参照,计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.3%,相对峰面积的RSD均小于5.8%,表明该方法重复性良好。

1.7药效试验方法 将BALB/C小鼠随机分为7组,每组6只。空白组不给予任何处理;其他组小鼠采用咪喹莫特诱导银屑病:造模前采用脱毛膏脱去背部2.5 cm×2.5 cm范围的背毛,然后每天上午涂抹咪喹莫特乳膏65 mg/只,涂抹面积2 cm×2 cm,连续7 d。造模期间同时每天下午给予治疗(除模型组),空白凝胶组涂抹空白凝胶剂,他克莫司组涂抹他克莫司软膏,参花方水提物组、参花方醇提物组、参花方水提醇沉物组分别涂抹相应的凝胶剂,均50 mg/只。实验期间,每天测定各组小鼠体重,观察小鼠皮损变化情况。第8天,参考文献[12],依据银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)评分标准对小鼠病变部位相应红斑、鳞屑及浸润增厚程度进行评分,三者总和即为PASI评分;然后处死小鼠,取皮损皮肤,多聚甲醛固定,石蜡切片,进行HE染色病理学观察。

1.8统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0进行数据统计分析,数据组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1指纹图谱的生成及相似度评价 参花方按照水提、醇提、水提醇沉工艺各制备3批干浸膏,按照“1.6.2”项下操作,制备成供试品溶液,按“1.6.3”项下色谱条件进样,记录色谱图。将得到的色谱图导入《中药指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件中,以其中1批水提法得到的干浸膏样品(S1)的图谱作为参照指纹图谱(R),计算得到参花方不同工艺提取物的相似度≥0.922,相似度结果见表1,总体上样品之前质量相对稳定;不同工艺提取物的HPLC图整体峰形一致,共有18个色谱峰是共有的,确定它们为共有指纹峰,叠加图谱见图1。

图1 参花方水提物(S1～S3)、醇提物(S4～S6)及水提醇沉物(S7～S9)HPLC指纹图谱叠加图谱

表1 参花方水提、醇提、水提醇沉提取物的指纹图谱相似度评价

2.2共有峰的指认 取“1.6.1”项下混合对照品溶液,按“1.6.3”项下色谱条件进样,记录色谱图(见图2)。将对照品图谱与参花方的叠加图谱进行比较,即将图1和图2进行比对,指认峰1为苦参碱,峰5为绿原酸,峰12为木犀草苷,峰17为蒙花苷4个特征峰。

注:1为苦参碱;5为绿原酸;12为木犀草苷;17为蒙花苷

2.3参花方抗银屑病的药效

2.3.1对银屑病小鼠临床症状的影响 与空白组比较,实验过程中模型组小鼠体重显著下降,第3天体重下降至约90%,之后几天在低位波动;背部皮肤覆盖厚重鳞屑,显著增厚隆起,鳞屑下皮肤红肿,PASI评分高达10.5分,表明银屑病样小鼠建模成功。空白凝胶组小鼠皮肤覆盖厚重鳞屑,增厚明显,皮损的鳞屑、红斑、增厚评分及PASI评分与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),表明空白凝胶不干扰参花方以凝胶剂进行药效考察。参花方各组及他克莫司组小鼠体重下降趋势有所缓解,但与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。参花方各组及他克莫司组小鼠皮损的鳞屑、红斑、增厚评分及PASI评分均明显低于模型组(P均<0.05),其中参花方水提物组小鼠鳞屑、红斑、增厚评分及PASI评分降低最明显,背部鳞屑覆盖不全,轻微鳞屑,皮损较轻;参花方醇提物组小鼠背部覆盖中度鳞屑,皮损中度隆起;参花方水提醇沉物组小鼠背部覆盖大部分鳞屑,皮损中度隆起。见图3。

图3 空白组和银屑病各组小鼠皮损情况、皮损PASI评分及体重变化

2.3.2对银屑病小鼠皮肤组织形态学的影响 空白组小鼠的皮肤结构完整,表皮无增厚,未见角化过度和角化不全,表皮颗粒层清晰,真皮周围无炎性细胞浸润;模型组和空白凝胶组小鼠表皮增厚明显,存在角质层角化不全及大量炎性细胞浸润,表皮厚度均明显高于空白组(P均<0.05),但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05);参花方各组及他克莫司组小鼠表皮增厚、角化不全及炎性浸润均有不同程度的改善,表皮厚度均明显低于模型组(P均<0.05),其中参花方水提物组皮肤组织病理改变改善最优。见图4。

图4 空白组和银屑病各组小鼠皮肤HE染色表现及表皮厚度比较

2.4基于灰色关联度的谱效关系

2.4.2灰色关联度分析 根据“2.4.1”项下处理后的结果,分别计算各母序列与子序列之间的灰色关联系数的平均值,即灰色关联度(r)。根据灰色关联原理可知,随着关联度的增大,子序列和母序列之间的相关性也就越强,当关联度大于0.5时,表示该色谱峰代表的化学成分与药效指标有关联性;当关联度大于0.8时,表示该色谱峰代表的化学成分与药效指标有较大关联性。计算得到的关联性结果见表2～4。参花方的18个共有峰与降低银屑病药效指标PASI评分能力的关联度为0.556 1～0.834 8,其中有16个峰与PASI评分有明显相关性(关联度>0.8);共有峰与恢复至正常表皮厚度能力的关联度为0.461 2～0.911 0,其中有15个峰与表皮厚度有明显关联性;以PASI评分和表皮厚度按相同权重比计算而得的综合药效指标与各共有峰关联性结果显示,有15个峰与药效有明显关联性,相关度为0.824 3～0.862 0,按相关性由大到小排名依次为峰2,9,4,8,11,10,13,3,6,7,16,5(绿原酸),14,15,1(苦参碱)。综合两种指标的灰色关联度分析结果,参花方18个共有峰中有15个在抗银屑病作用方面具有主要贡献,且总体关联性均大于0.8;其余3个共有峰中峰12(木樨草苷)及峰17(蒙花苷)的关联度大于0.6,峰18的关联度大于0.5,对银屑病的治疗作用也有关联性。表明参花方的作用与其组方的4味药材密切相关,是复方多组分综合效应的结果。

表2 银屑病小鼠PASI评分与各特征峰峰面积关联度

表3 银屑病小鼠表皮厚度与各特征峰峰面积关联度

表4 银屑病小鼠药效指标与各特征峰峰面积关联度

3 讨 论

参花方是治疗银屑病的有效经验方,临床沿用水提工艺制备洗剂供患者药浴,进行新药开发还需对其提取工艺进行验证、对其治疗银屑病的物质基础进行探索。本研究建立了参花方不同工艺提取物的指纹图谱,前期对提取物干浸膏供试品制备过程中不同提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)进行了考察,发现用甲醇作为提取溶剂时,图谱出峰更为丰富,故选择甲醇作为干浸膏的提取溶剂;对不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)进行了优化,发现甲醇-水作为流动相体系时基线不平且漂移严重,乙腈-水基线较平稳,乙腈-0.1%磷酸溶液基线平稳且出峰更多,故选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相体系;在检测波长选择过程中,进行紫外全波长(200～400 nm)扫描,扫描结果发现检测波长为210 nm时出峰最多,信号强,大多数峰的峰面积值较大,故选择210 nm作为参花方HPLC指纹图谱的检测波长。本研究对参花方指纹图谱的色谱条件、样品处理、方法学等均进行了详细的考察,为参花方质量标准提升及新药开发奠定了基础。

本研究采用药效学为导向的提取工艺筛选策略,建立了文献常用的咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型,比较水提、醇提、水提醇沉法的提取物对银屑病样皮损的治疗作用,证实水提法为最优提取工艺。此外,在参花方不同提取物HPLC指纹图谱特征峰与其抗银屑病作用数据量化的基础上,采用灰色关联度分析法对参花方不同提取物指纹图谱特征峰与抗银屑病作用的贡献大小进行相关性分析,表明各特征峰与降低PASI评分能力的关联度均大于0.5,18个共有峰中除峰17、峰18,其余峰与PASI评分关联度均大于0.8,对抗银屑病作用均有较大贡献;在表皮厚度数据中,除18号峰,各特征峰的关联度亦大于0.5,除峰12、峰17、峰18,其余15个特征峰与表皮厚度关联度大于0.8,对银屑病治疗作用有较大贡献;以PASI评分及表皮厚度按相同权重比计算而得的综合银屑病药效数据显示,18个共有峰均与银屑病药效有关联性,其中15个特征峰的关联度大于0.8,有明显关联性,表明参花方抗银屑病作用是多种成分共同作用的结果。

中药复方成分众多,药效物质基础不清晰一直是制约中药国际化的重要瓶颈之一[14]。传统研究方法是植化分离法,通过对中药的提取、分离、解析,明晰其结构,并在此基础上结合药理模型对纯化后的成分进行相应的药效验证[15]。该方法虽然为阐明中药物质基础起到了积极的推动作用,但是却忽略了中药各成分之间的协同作用,往往导致中药化学成分越分越细,而细小、微量成分无法发挥中药整体协同的药效[16-17]。针对中药多成分、多靶点、整体调节等特点,建立在中药指纹图谱研究基础上,将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效联系起来,进而筛选出与药效密切关联的成分的理论,即谱效关系学。相比于其他研究方法,谱效关系学不仅高效、经济、环保,更能体现中医药的整体观理念。本研究对参花方治疗银屑病的化学物质基础群进行了初步研究,获得了指纹图谱中各特征峰所代表的化学成分对体内抗银屑病作用贡献的大小顺序,为参花方新药开发的物质基础研究奠定了基础。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。