中性粒细胞胞外陷阱在慢性阻塞性肺疾病中的作用

许金回，岳红梅，2，刘苗苗，李雅亭，武兴东，朱浩斌

1兰州大学第一临床医学院，兰州 730000 2兰州大学第一医院呼吸与危重症医学科，兰州 730000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由于呼吸道和肺泡异常所引起的慢性疾病，其发病机制与肺部异常炎症有关[1]，主要特征是持续性气流受限、中性粒细胞浸润增加和反复感染[2]。中性粒细胞是COPD病情进程中肺内浸润的关键细胞，作为抵御病原体侵袭的第一道防线，发生感染时中性粒细胞首先趋化至损伤部位，通过脱芽、吞噬、分泌细胞因子及形成中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)的方式清除病原体，在呼吸道疾病调控中发挥核心作用[3]。

NETs是一种网状结构，由中性粒细胞释放的染色质和颗粒蛋白[如中性粒细胞弹性酶(neutrophil elastase，NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)]等内容物形成，并以非定向方式在侵入机体的微生物附近释放，发挥捕获和消灭病原菌的作用，从而抵御感染，尤其在因体积过大导致中性粒细胞无法吞噬病原体的清除中发挥重要作用[4]。最新研究认为，NETs可直接对肺上皮和内皮细胞产生细胞毒性，在肺炎、COPD和哮喘等慢性呼吸道疾病中均可见NETs过量产生，对已形成的NETs进行破坏有望成为COPD治疗的一种新模式[5]。虽然吸烟、遗传、早期生活事件、有害环境暴露等传统危险因素与COPD的发生均具有一定相关性，但由于发病机制复杂，不同危险因素所致的COPD在病理生理机制和临床表现方面存在一定程度的差异，从而影响临床诊疗，故迫切需要可靶向治疗COPD的药物，而NETs作为中性粒细胞衍生物，参与了COPD病情进展，有望作为COPD的潜在治疗靶点。本文主要围绕COPD发病机制、NETs形成机制、NETs在COPD进展与治疗中的作用展开论述，以期为进一步研究提供更多理论依据。

1 COPD发病机制

COPD是一种渐进性的肺部异质性疾病，其发生是多种因素共同作用的结果，如长期暴露于烟草烟雾、粉尘或其他有害环境时，大量外源物和氧自由基将引起免疫细胞激活、募集，从而破坏肺内稳态，引起肺形态和功能发生不可逆性改变[6]；反复的细菌感染、中性粒细胞浸润将影响平滑肌功能，最终促使呼吸道发生结构重塑和瘢痕形成[7]。目前普遍认为氧化应激、低级别慢性呼吸道炎症以及蛋白酶-抗蛋白酶表达失衡是COPD发生与病情进展的主要机制。

1.1 氧化应激

氧化应激是COPD发病的关键机制。在多种有害因子的长期刺激下，外源性氧化剂与肺部炎症均可诱导内源性活性氧(reactive Oxygen species，ROS)过量产生，以致机体氧化应激增强，直接破坏多种生物大分子结构，引起细胞代谢异常。大量研究揭示Nrf2介导的氧化应激途径和线粒体功能障碍途径，可通过全身氧化应激引起DNA损伤，导致肌无力、肺纤维化、肺气肿、肺部衰老加速，同时具有慢性炎症放大效应，可驱动黏蛋白、低聚黏液形成以阻塞呼吸道，加剧COPD恶化[8-9]。Zhang等[10]研究表明，氧化应激可影响sirtuin家族成员表达与活化，通过调节核因子-κappa B(nuclear factor-κappa B，NF-κB)、转化生长因子β1 (transforming growth factor-β，TGF-β1)及PI3K/mTOR信号通路调控炎症反应、自噬和凋亡过程，进而影响COPD病程。此外，氧化应激可直接作用于端粒并影响其长度，从而加速细胞衰老、影响肺功能[11]。

1.2 低级别慢性呼吸道炎症

呼吸道和肺实质慢性炎症浸润是COPD的主要特征，其发生与适应性和先天性免疫系统激活有关。首先，在有害因素的刺激下，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CXC 趋化因子配体8(cysteine X chemokine ligand 8，CXCL8)等被大量释放，驱动了呼吸道炎症级联反应[12]，其引起的肺组织损伤为COPD的发生创造了条件。其次，发生COPD后，PI3K信号通路及其下游介质(如蛋白激酶B、磷酸酶和紧张素同源物)表达增多，可诱发炎症、先天性和适应性免疫、氧化应激恶性循环[13]。此外，中性粒细胞在呼吸道黏膜抗微生物侵袭中发挥重要作用，一方面，作为先天性免疫的重要组成部分，中性粒细胞通过吞噬、脱颗粒及释放NETs抵抗病原体侵袭和细胞碎片清除[14]；另一方面，其衍生的蛋白酶可直接干扰IL-22/IL-22R信号通路的活性，降低抗菌效应物表达，继而有利于病原体复制，导致COPD病情加重[15]。

1.3 蛋白酶-抗蛋白酶表达失衡

蛋白酶对组织有损伤、降解作用，而抗蛋白酶对多种蛋白酶具有抑制作用，蛋白酶-抗蛋白酶表达平衡是维持机体正常免疫反应的重要基础，故蛋白酶和抗蛋白酶表达失衡将导致肺实质被破坏，是COPD发生和发展的另一关键因素[16]。生理条件下蛋白酶-抗蛋白酶处于平衡状态，在内外源性影响因素的作用下，如遗传因素所致α-1抗胰蛋白酶缺乏、外界有害环境的长期刺激，该平衡被打破后可上调中性粒细胞和巨噬细胞分泌的蛋白酶水平，使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、弹性蛋白纤维及胶原发生降解，可直接破坏肺实质正常结构，促进COPD进展[17]；此外，降解的ECM可产生趋化肽片段，诱使巨噬细胞和中性粒细胞持续存在，从而加剧COPD炎症反应和蛋白酶-抗蛋白酶表达失衡，进一步加重COPD[18]。

1.4 其他发病机制

COPD在老年人群中具有较高的发病率，表明年龄相关改变可能是COPD的促进因素，这可能与细胞衰老、端粒缩短以及DNA修复缺陷相关[19]。但目前此方面尚缺乏系统性研究，有待高质量临床试验加以验证。

2 NETs形成机制

NETs是由中性粒细胞活化后释放，以DNA为骨架，表面嵌有组蛋白、MPO、NE，具有杀菌作用的网状蛋白[20]。早期研究认为，NETs通过捕获细菌并限制其传播而对机体发挥有益作用，近年大量研究揭示NETs具有多方面功能，如在慢性炎症过程中，过度形成或无法清除的NETs可引起组织损伤、不受控制的炎症和纤维化，并阻止中性粒细胞发挥组织修复功能。目前认为，NETs主要包含以下3种形成机制。

2.1 NADPH氧化酶依赖性NETs的形成

作为最先被发现的NETs形成机制，NADPH氧化酶依赖性NETs主要形成于中性粒细胞被各种刺激物激活后的3～8 h。在形成过程中，中性粒细胞将经历核膜解体、染色质去浓缩、中性粒细胞死亡等一系列反应，其中染色质去浓缩为关键步骤。此类NETs形成过程主要通过PKC-Raf-MERK-ERK途径激活NADPH氧化酶复合物，产生高浓度ROS、触发下游染色质去浓缩的级联信号、激活MPO和NE，而激活的NE易位至细胞核，可通过核心蛋白降解的方式破坏染色质外包装，随后MPO与染色质相结合并与NE协作进一步去浓缩，为NETs的形成奠定了基础[21]。即一方面通过ROS将NE和MPO转移至细胞核以促进染色质去浓缩；另一方面，细胞外Ca2+内流可激活肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(protein arginine deiminase 4，PAD4)，使组蛋白发生瓜氨酸化并下调与DNA的结合力，最终导致染色质去浓缩、NETs被释放至细胞质中，在质膜渗透、中性粒细胞死亡时将NETs排出[22]。

2.2 非NADPH氧化酶依赖性NETs的形成

此类NETs的形成通常发生于中性粒细胞活化后的5～60 min内，其不依赖于NADPH氧化酶，主要在中性粒细胞抵抗金黄色葡萄球菌和白色念珠菌过程中由Toll样受体2/4和补体蛋白C3所触发。在此过程中，细胞核DNA与细胞质发生融合，DNA-蛋白质复合物包裹于囊泡中，在特定情况下排出细胞形成NETs。此类NETs的形成不影响中性粒细胞寿命，其仍可正常吞噬病原体[23]。

2.3 线粒体相关NETs的形成

该途径NETs的形成通常发生于中性粒细胞激活后15 min内。当中性粒细胞接收到粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子或补体因子5a的刺激信号时，线粒体DNA被释放并形成NETs，而中性粒细胞亦不会死亡[24]。

3 NETs在COPD中的作用

作为全球性健康问题，目前临床治疗COPD的药物尚无法逆转病情或完全抑制炎症状态，亟需探寻新的治疗策略，以打破COPD疾病进程、减少肺功能衰退、降低不良事件发生率及死亡率。中性粒细胞持续聚集是COPD的重要特征之一，作为中性粒细胞释放的重要介质，NETs可通过其组分的细胞毒性及促炎作用，调节COPD病情进展。研究显示，COPD患者中NETs及其组分水平与先天性免疫应答标志物具有相关性，可通过促进自身免疫反应以间接诱导肺组织损伤[4]。如NE作为NETs发挥免疫防御功能的关键成分，可直接消化抗炎分子颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)并通过其产物诱导IL-8表达，以形成炎症恶性循环，引起ROS大量累积、呼吸道上皮与肺泡血管内皮功能损伤，增加COPD发生风险[25]。在感染所致的COPD中，病原体可通过多种机制驱动NETs形成，以降解呼吸道上皮宿主防御蛋白、损害机体的防御功能，使患者更易受到细菌感染，从而发生全身炎症和组织损伤，促进COPD进展[26]。商安全等[27]研究显示，中性粒细胞持续聚集可引起NETs异常释放，以致呼吸道阻塞、肺功能下降，可能为COPD的诱发因素。吸烟导致COPD患者外周血中性粒细胞更易诱导、表达NETs，且与非吸烟者相比，吸烟者痰液中NETs相关蛋白含量更高，并加剧炎症和肺组织损伤，加速COPD病程[28]；游离DNA、MPO等NETs活性成分在COPD患者外周血中呈高水平表达，亦可促进炎症级联放大和持续进展，使呼吸道炎症和组织损伤永久化[29]。此外，COPD患者的肺组织巨噬细胞清除能力呈降低状态，高水平促炎细胞因子和中性粒细胞趋化因子可形成正反馈，使呼吸道中性粒细胞数量持续增加、NETs水平持续升高，而NETs可与呼吸道上皮细胞受体相结合并促进其释放炎症因子，以致呼吸道黏液高分泌；同时NE作为呼吸道杯状细胞的促分泌剂，可诱导低聚黏液形成，进一步加剧呼吸道阻塞，引起持续性气流受限，导致COPD进展[30-31]。临床报道显示，COPD稳定期患者痰液中NETs形成增多，并与呼吸道中性粒细胞数量、气流受限程度、肺功能受损及疾病严重程度呈正相关[32]；在COPD急性加重期，90%以上患者痰液中可检测到NETs且其浓度与疾病加重频率、疾病严重程度亦具有相关性[33]。故NETs及其组分介导的组织损伤可能是COPD进展的重要机制，可通过靶向调控NETs形成进行COPD防治。目前临床针对COPD的治疗方法(尤其在急性发作期时)均为广泛的对症性治疗，若结合COPD病因，探寻有效的生物标志物，将有助于指导当前的临床干预策略，实现更精准的个体化治疗。

4 靶向NETs的COPD治疗策略

中性粒细胞作为多种慢性肺部疾病病理生理的重要组成部分，通过局部而非全身应用拮抗剂对中性粒细胞的IL-8受体进行干预已成为减轻中性粒细胞所致肺组织损伤的有效方法。调控NETs形成的治疗策略被证实可减轻慢性呼吸道炎症，降低疾病严重程度，相关临床试验在陆续开展中。研究证实，CXCR2拮抗剂有助于减少肺部中性粒细胞浸润，从而限制肺组织进一步损伤[34]，提示靶向调控NETs形成一定程度上对中性粒细胞的功能具有调节作用，最终达到治疗COPD的目的。目前，通过抑制NETs形成进而发挥COPD治疗作用的药物靶点主要包括蛋白酶抑制剂、CXCR2拮抗剂、NADPH/ROS抑制剂、脱氧核糖核酸酶及其他抑制剂。

4.1 蛋白酶抑制剂

在NADPH氧化酶依赖性NETs形成过程中，NE和MPO参与了染色质去浓缩，故抑制此两种蛋白功能理论上可达到减少NETs产生的目的。α-1抗胰蛋白酶和分泌性白细胞蛋白酶抑制因子均为内源性NE抑制剂，有助于维持蛋白酶-抗蛋白酶平衡，防止蛋白酶异常所引起的组织损伤，二者缺乏与呼吸道疾病流行具有相关性。AZD9668为一种口服性NE抑制剂，主要用于α-1抗胰蛋白酶缺乏症的治疗，随机、双盲、安慰剂对照临床试验显示，AZD9668可改善COPD患者的炎症状态，但对肺功能的逆转效果不显著，且部分患者出现转氨酶升高，其是否由药物副作用引起尚存争论，给药剂量及药物服用时间亦不清晰[35]。GW311616A为一种选择性NE抑制剂，通过阻断NE核易位和染色质去浓缩进而干扰NETs的形成，在COPD小鼠模型中被证实可阻止ROS和NETs生成，并具有改善肺功能的作用[6]。针对MPO的抑制剂正在研发中，如AZM198通过抑制MPO活性在体外实验中可显著阻碍NETs形成、减轻中性粒细胞介导的内皮细胞损伤[36]。与之类似，MPO抑制剂氨基苯甲酸酰肼亦可延缓NETs形成，减轻中性粒细胞引起的炎症损伤[37]。总体而言，虽然蛋白酶抑制剂在COPD的治疗中具有巨大的应用潜能，但相关文献多为动物实验或体外研究，其在临床中的治疗效果尚待验证，且治疗剂量与潜在毒性作用等亦需警惕。

4.2 CXCR2拮抗剂

在COPD患者呼吸道分泌物中，CXCL8作为主要的中性粒细胞趋化因子，可通过CXC趋化因子受体(cysteine X chemokine receptor 1，CXCR)1和CXCR2发挥作用，其中CXCR1可促进中性粒细胞脱颗粒，CXCR2可诱导中性粒细胞通过循环系统向局部组织募集。临床数据显示，COPD急性加重期患者支气管分泌物中CXCR1和CXCR2表达均升高，而体外实验表明，中性粒细胞释放NETs主要受CXCR2的调控[38]。AZD5069是一种选择性CXCR2拮抗剂，可抑制COPD患者痰液和血清中性粒细胞形成NETs，以减弱炎症损伤，促进组织修复，但并未显著改善临床结局[39]。另一种选择性CXCR2抑制剂SCH527123在小鼠模型中可观察到具有降低呼吸道分泌物中性粒细胞、MPO水平的作用，从而减少NETs形成[40]。与上述研究类似，在一项双盲安慰剂对照研究中发现，CXCR2拮抗剂(MK-7123，50 mg)可显著减低中重度COPD患者痰液中性粒细胞水平，改善吸烟者第1秒用力呼气容积[41]。综上，CXCR2拮抗剂可有效阻断中性粒细胞向呼吸道迁移，阻止其向呼吸道释放炎症蛋白酶，继而弱化了中性粒细胞相关炎症损伤，可作为COPD潜在的抗炎治疗药物，但此类抑制剂对肺功能的改善作用尚存争议。

4.3 NADPH氧化酶/ROS抑制剂

NADPH氧化酶是NETs形成的重要介质，而ROS是NETs形成的重要诱导剂，通过对二者进行功能抑制有助于干扰NETs形成。研究显示，二苯二氯铵(DPI)可通过抑制NADPH氧化酶的活性，进而下调氧化应激反应、减少NETs形成[42]。与之类似，作为一种抗氧化剂，n-乙酰半胱氨酸可降低痰液黏度，其与DPI均可减少炎症细胞因子和ROS产生，从而阻碍NETs的形成，改善哮喘患者肺功能[34，43]，且在COPD患者中n-乙酰半胱氨酸可降低急性加重期风险[44]。羟氯喹是一种抗疟疾药物，通过抑制体内NADPH氧化酶及细胞因子，下调ROS产生，并介导基质金属蛋白酶-金属蛋白酶组织抑制因子的相互作用，有助于维持ECM稳态，对NETs的形成具有抑制作用[45]，有望应用于类风湿关节炎、COPD等炎症疾病的治疗，扩宽临床适应证。作为广泛应用的降糖药二甲双胍，在糖尿病前期患者中一方面可通过抑制NADPH氧化酶活性，另一方面可减少NETs有效组分如NE、组蛋白、细胞外DNA表达，对NETs的形成产生阻碍[46]。

4.4 脱氧核糖核酸酶

DNA为NETs的重要支架结构，亦具有抗菌成分，细胞外DNA水平增加与多种慢性肺部疾病严重程度具有相关性，故通过脱氧核糖核酸酶降解DNA有望成为潜在的COPD治疗靶点。在嗜中性粒细胞哮喘小鼠模型中，脱氧核糖核酸酶可显著降低MPO表达水平，减轻气道高反应性和呼吸道黏液阻塞，继而改善肺功能，减少病情恶化[47]。此结果在临床研究中得到了进一步验证，Lachowic-Scroggins等[48]研究证明，通过脱氧核糖核酸酶破坏DNA结构，进而干扰NETs的形成可发挥预防NETs对哮喘患者呼吸道上皮损伤作用，期待后续针对COPD患者的相关研究成果发表。此外，该酶亦会对肺组织造成损伤，并可能加重病情，需提高警惕。

4.5 其他抑制剂

白三烯是炎症细胞合成的重要炎症介质，参与炎症反应的诱导并被视为潜在的抗炎靶点，一项纳入17例接受口服白三烯抑制剂治疗的慢性支气管炎伴COPD患者的研究显示，该药物对中性粒细胞介导的炎症反应具有一定程度的缓解作用[26]。甲氰咪胍作为PAD4抑制剂在小鼠模型中可观察到具有下调中性粒细胞计数、降低瓜氨酸组蛋白和炎症因子水平的作用，进而抑制NETs形成和组织损伤[49]，且该结果在一项针对链霉素(PAD4抑制剂)的临床研究中得到进一步验证，研究者发现链霉素可降低溃疡性结肠炎患者结肠活检组织中瓜氨酸组蛋白和促炎细胞因子表达水平[50]。此外，PAD4抑制剂对流感嗜血杆菌感染诱导的中性粒细胞形成、NETs释放亦具有抑制作用[51]。作为抗菌类药物，大环内酯类被证实可抑制NETs形成，在免疫调节中发挥重要作用。动物实验显示，接受红霉素治疗的小鼠呼吸道NETs减少、肺部炎症减轻，且后续研究证实红霉素对NETs的形成具有抑制作用[52]，提示大环内酯类药物可能通过抑制NETs形成进而发挥慢性炎症治疗作用。

5 小结

作为中性粒细胞发挥免疫调节功能的重要形式，NETs被证实在COPD患者中常呈异常表达，并与病情进展具有一定相关性，而靶向NETs的治疗策略为COPD的治疗提供了新选择，且动物模型及小样本临床研究数据表明具有较好的应用前景，但基于NETs对COPD进行治疗的方案仍面临诸多挑战：(1)相关研究成果多来源于动物实验，且异质性较大；(2)尚缺乏高质量的临床试验对靶向药物进行安全性和有效性验证，以阐明相关药物的具体作用机制、患者病理改变、有效剂量与剂量反应关系、不良反应等，且在应用于临床实践前，尚需制定明确的用药指导指南。相信未来随着对NETs治疗COPD作用机制的进一步明确，将为NETs靶向药物的临床应用提供更多依据和理论基础，同时有助于探寻更多的潜在治疗靶点，为COPD靶向药物的研发提供新思路。

作者贡献：许金回负责文献检索、论文撰写；刘苗苗、李雅亭、武兴东、朱浩斌负责论文修订；岳红梅负责提供论文写作思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突