超高效液相色谱-串联质谱法研究木瓜中熊果酸和齐墩果酸含量

◎ 李海燕

（怒江州食品药品检验所，云南 怒江 673199）

酸木瓜[Pseudocydonia sinensis(Thouin) C.K.Schneid.]别名邹皮木瓜、木瓜海棠、木瓜等，是蔷薇科木瓜属灌木或小乔木[1]。酸木瓜中含较多果酸和单宁，吃起来酸、涩，解腻开胃，舒筋湿痹，在云南人的生活和菜品中多为常见。《诗经》记载：“投我以木瓜，报之以琼琚。”古人将酸木瓜视为和“琼琚”一般美好的事物。古籍中对酸木瓜的记载还有很多，关于木瓜泡酒早有记载。《齐民要术》记载，木瓜以苦酒鼓汁，密度之，可按酒食，密封藏百日，乃食之，甚益人。酸木瓜中的主要化学成分有熊果酸、齐墩果酸、苹果酸、绿原酸、芦丁、多糖、黄酮、鞣质等[2]。其中，熊果酸和齐墩果酸为五环三萜有机酸。据文献报道，齐墩果酸可消炎抑菌，降低转氨酶，促进肝细胞再生，防止肝硬化，强心、利尿、降血脂、降血糖，增强机体免疫力[3]。熊果酸是齐墩果酸的同分异构体，药理研究证明，熊果酸具有抗癌、促进免疫、稳定心血管、增强毛细血管弹性等作用。由于木瓜具有药用、食用、观赏等多种用途，越来越受人们的喜爱。基于此，本文采用有机溶剂超声提取，离心，旋转浓缩，C18 柱净化，正己烷洗脱，氮吹，旨在探索酸木瓜中熊果酸和齐墩果酸的提取工艺。实验结果表明，这种方法快速，且样品损失较小，克服了传统方法的不足，具有高效、简便、快速、重复性好的优点，可以为木瓜的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂、材料

①仪器。岛津液相色谱仪LC-30A，与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用系统；GH252 双量程电子天平；超声提取仪；艾本德离心机；旋转蒸发仪；氮吹仪。②试剂。甲醇、正己烷、乙醇，均为色谱纯；C18 固相萃取柱。③材料。熊果酸、齐墩果酸标准品（中国食品药品检定院）。

1.2 分析条件

液相色谱条件：XRODS-Ⅲ（2.0 mmI.D×75 mm，1.6 μm）；流动相：A－甲醇，B－纯水；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；质谱条件：扫离子模式，多反应监测（MRM），负离子扫描模式。

用1 μg·mL-1熊果酸和齐墩果酸标准品进行一级质谱和二级质谱扫描，并做电压优化，确定熊果酸和齐墩果酸的母离子为455.3，子离子为455.45，锥孔电压熊果酸为25 V，齐墩果酸为28 V，碰撞电压均为24 V。

1.3 样品前处理

1.3.1 熊果酸和齐墩果酸2 种不同前处理方法比较

（1）方法1。取5 批次怒江州泸水市老窝乡不同产地的酸木瓜鲜果，去核、粉碎，精密称定5.0 g，于50 mL 具塞离心管中，加入50 mL 乙醇，70 ℃超声提取30 min，8 000 r 离心，取上清液过0.22 μm 针筒过滤头，滤液供液相色谱-串联质谱分析[4]。

（2）方法2。取5 批次怒江州泸水市老窝乡不同产地的酸木瓜鲜果，去核、粉碎，精密称定5.0 g，于50 mL 具塞离心管中，加入50 mL 乙醇，振荡提取20 min，8 000 r 离心，将离心液转入100 mL 鸡心瓶，旋转蒸发到5 mL，过C18 固相柱（5 mL 甲醇，5 mL水活化固相柱），用5%乙醇水冲洗小柱2 次，再用6 mL 正己烷洗脱，收集洗脱液，50 ℃氮吹干，准确加入1 mL 初始流动相溶解，过0.22 μm 针筒过滤头，滤液供液相色谱-串联质谱分析。

1.3.2 标准溶液配制

精密称定熊果酸和齐墩果酸标准品各10.0 mg 用甲醇定容至10 mL，配成1.0 mg·mL-1的母液，再用初始流动相稀释配成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg·mL-1标准工作液。

2 结果与讨论

2.1 标准溶液的MRM 色谱图

0.02 ng·mL-1混合标液的MRM 色谱图，如图1所示。

图1 0.02 ng·mL-1 混合标液的MRM 色谱图

2.2 标准曲线线性关系与检出限、定量限

将混合标准工作液按1.2 中的分析条件进行测定，在1.2 色谱条件下依次进样测定，以待测化合物的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。该方法熊果酸的线性方程为Fx=3.952 9e+007*x+104 321，相关系数为0.999 938 6；齐墩果酸的线性方程为Fx=3.797 90e+007*x+386 09.2，相关系数为0.999 177 1。熊果酸和齐墩果酸线性范围均为0.001～0.2 μg·mL-1，峰面积在该线性范围内线性关系良好。用初始流动相逐级稀释对照品混合液，在1.2 色谱条件下进样，以3倍信噪比对应的溶液浓度为方法检出限，该法的熊果酸和齐墩果酸的检出限均为0.000 2 mg·kg-1。

2.3 2 种提取方法对结果的影响

实验表明，以5 号样品为例，方法1 用乙醇超声提取后直接上机测定，得到的色谱峰比较杂乱，基线不平稳，待测物含量偏低。方法2 用乙醇振荡提取后，旋转蒸发浓缩，过C18 固相柱，正己烷洗脱、氮吹后，上机测定的结果待测物含量偏高，杂峰干扰少，基线平稳，因为浓缩、过柱能去除大分子物质和一些杂质，降低离子抑制程度，提高分析的灵敏度[5]。2 种提取方法所得色谱图，分别如图2、3 所示。

图2 方法1 所得的色谱图

图3 方法2 所得的色谱图

2.4 精密度试验

将5 号酸木瓜样品按1.2 中分析条件进行重复进样6 次。熊果酸（n=6）的保留时间（RSD%）为3.619%，色谱峰面积分别为2 942 307、2 986 988、2 792 078、2 814 979、2 799 595、2 766 655，平均峰面积为2 851 285，峰面积（n=6）的（RSD%）为2.913，齐墩果酸（n=6）的保留时间（RSD%）为3.313%，色谱峰面积分别为2 663 911、2 591 525、2 539 461、2 572 418、2 536 866、2 506 049，平均峰面积为2 569 431，峰面积（n=6）的（RSD%）为1.974。由此可知，该方法仪器精度良好，满足检测要求。

2.5 加标回收试验

取5 个木瓜样品，加入适量的熊果酸和齐墩果酸对照品，按1.3 样品前处理方法进行样品前处理，按1.2中分析条件进行加标回收试验，熊果酸和齐墩果酸加标回收率结果如表1 所示。

表1 熊果酸和齐墩果酸加样回收试验表

3 结论

本文初步研究了云南省怒江州泸水市老窝乡的酸木瓜中熊果酸和齐墩果酸含量，采用液相色谱-串联质谱法测定其含量，从提取工艺中得知，样品经提取、浓缩，通过C18 固相柱后，可以有效减少杂质干扰。结果表明，该方法准确、可靠，可以为酸木瓜的开发利用提供可靠依据。