大豆疫霉根腐病的防治及研究进展

周 扬 韩昕君 傅豪 李志辉

（漯河市农业科学院 河南漯河 462000）

大豆［Glycine max（L.）Merr.］不仅是一种重要的农作物， 也是重要的工业和饲料原料。 在大豆受侵发生的主要30 多种病害中[1]，大豆疫霉根腐病（Phytophthora root rot,PRR）是其中危害严重的病害之一。该病害发生于大豆的整个生育期， 其病原菌侵染植物的根、茎、叶和豆荚，引起茎部腐烂、植株矮化枯萎甚至死亡。 大豆疫霉根腐病能造成25%～50%的产量损失，在低温和高降雨年份为50%～80%，严重的地块甚至绝产[2-3]。 目前对于PRR 的抗性研究主要是利用新发掘的抗病基因和已知抗病基因培育抗病品种，但病原菌的致病机制、田间抗性机制与抗病机制之间的关系这些问题仍需解决。 因此，了解大豆疫霉根腐病的发生危害、抗源筛选、抗性机制等尤为重要。

1 PRR 研究概述

1.1 PRR 的发生与危害

PRR 由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起，于1989 年在我国黑龙江省地区被发现[4-5]，1991 年我国科学家沈崇尧首次分离出大豆疫霉菌[6]。 大豆疫霉根腐病在排水不佳、 地表易积水的黏性土壤中发生最为严重[7]，大豆疫霉菌使幼苗猝倒、 根腐与茎腐， 最后造成植株枯萎死亡， 疫霉菌的侵染还大大降低植株对其他病原菌的抵抗性[8]。 该病害对大豆产量造成严重影响， 在美国1996-2010 年共造成（0.68～1.55）×109kg 的损失[9]。 我国黑龙江每年受疫霉菌侵染的面积高达150 000 hm2[9]，PRR 在全国呈蔓延趋势[10]。

1.2 PRR 病原特征

大豆疫霉菌属于卵菌纲疫霉属，有至少59 个生理小种，还存在其他致病型[11]。 大豆疫霉菌菌落呈白色，形态均匀，主要以气生菌丝的形式存在，幼龄期菌丝无隔多核，随着生长变成分隔，菌丝体为多核[12]，老龄期形成结节状或不规则的菌丝膨大体， 呈大小不等的椭圆形或球形。 大豆疫霉菌既可以通过产生孢子囊、游动孢子和厚垣孢子的形式进行无性生殖，又可以通过分化出卵原细胞和雄器进行有性生殖。卵孢子在适宜的条件下萌芽产生芽管， 并进一步发展成为菌丝、 孢子囊。 菌丝生长的最适温度为25～28℃，最低5℃，最高35℃，因此PRR 在10℃时发病率最低，在25℃发病率最高[13]。 大豆疫霉菌在马铃薯培养基（PDA）上生长缓慢，在LBA、CA 和含有复杂营养元素的V8 培养基上生长较快[14]。

2 PRR 的发病特征

PRR 是典型的土传性真菌病害， 在整个生育期均可发生， 并能为害大豆的任何部位， 引起种子腐烂、出苗前死亡和出苗后钩壮期死亡[15]。 在种子萌发前，引起种子变褐腐烂；种子萌发后，引起大豆下胚轴系统性变褐腐烂；出苗后，近地根茎部出现褐色水渍状病斑，叶片变黄萎蔫，根茎变褐软化，引起幼苗萎蔫或死亡，此时期是幼苗最易受侵染的时期；成株期受侵染植株表现为叶片由下部到上部逐渐变黄并萎蔫， 分枝基部发病出现黑褐色病斑， 茎中空易折断，豆荚基部初期也会出现水渍状病斑，最后种子失水干瘪，籽粒萎缩，完全失去使用价值。

3 PRR 的防治

疫霉菌是一种能对大豆造成循环侵染的病害，其能在土壤中越冬， 待温度湿度适宜时释放孢子进行侵染[16]。 因此探索长期有效的防治方法尤为重要，目前主要有以下几种防治措施。

3.1 栽培防治

防治PRR 最主要的栽培措施是控制土壤湿度[17]，对于低洼地块可采用及时排水或高垄栽培进行管理[18]。 另外，由于大豆疫霉菌的游动孢子易通过水分进行传播，尤其在土壤通透性和排水性降低时大豆疫霉病更易发生，因此可以通过更改耕作方式、疏松土壤、建立高效的排水系统来减轻根腐病的发生[19]。

3.2 化学防治

PRR 可为害大豆任何生育阶段， 药剂防治比较困难，但利用高效、低毒、低残留的杀菌剂能达到短期防治效果[20]，常用的包括甲霜灵、精甲霜灵和恶霜灵，一般通过药剂拌种的方法操作[21]，方法为在种子中加入种子质量0.3%～25.0%的甲霜灵粉剂拌种。 由于甲霜灵能够通过抑制蛋白质和核酸的合成从而对卵菌纲产生影响，因此是一种常用的高效杀菌剂。 药剂喷雾处理也可有效控制病情，植株生长发育后期感病时可采用喷药或浇灌的方式，可选用58%甲霜·锰锌湿性粉剂600 倍液、69%安克·锰锌可湿性粉剂900 倍液等[22]。 此外，将甲霜灵、烯酰吗啉、霜脲氰和嘧菌酯两两复配形成的配比混合物， 也能显著增强其对大豆疫霉的抑制[23]。

3.3 生物防治

生物防治与化学防治相比更加安全， 对环境污染小， 目前发掘的能有效防治PRR 的生物药剂有“818”发酵液、45 mg/L 的Harpins 蛋白、恩益碧种衣剂[24]、嗜线虫杆菌、亮盾种衣剂等，其中Harpins 蛋白[25]、嗜线虫杆菌[26]、亮盾种衣剂[27]的防治效果最好。然而生物制剂控制病害见效较慢， 并且不易批量生产，因此不能作为主要防治措施。

3.4 培育抗耐病品种

由于杀菌剂、 田间排水等措施不能有效控制PRR，抗耐病的大豆不仅成本低廉，还有较强的控制作用， 因此培育和种植抗病品种是最为经济有效的方法[28-30]。 大豆与大豆疫霉菌的相互作用符合基因对基因假说，疫霉具有高度遗传变异的特点，抗病基因可完全抵抗病害， 但新的毒力小种的出现会导致抗病品种的抗性丧失[31-33]。 在我国，不同疫霉菌群体多样性是复杂的，生产上为了延长品种的抗性年限，最为理想的是利用拥有多个抗性的单基因系品种。 目前研究表明， 河南大豆品种是优质的对PRR 具有抗性的种质资源[34-35]，许多品种具有广谱抗病性，其中大豆品种郑97196 是国内筛选到的优异抗源之一，其对大豆疫霉菌株HeN35 表现为完全抗性[36-38]。

从以上几种防治措施来看， 单一的方式都具有一定的缺点，比如田间管理成本较高，栽培措施不能从根本上控制病害； 化学防治中长期使用药剂可能使大豆疫霉对其产生抗病性； 由于大豆疫霉的病原变异性高，品种的抗性不能一直持续。 因此，结合单一防控措施，多方位综合治理，能够有效控制PRR 的发生及蔓延。

3.4.1 PRR 抗性类型 大豆对PRR 的抗性有2 种，一种是受抗性基因（Rps）控制的小种专化抗性，又称为质量抗性，符合“基因对基因”假说原理，大豆疫霉抗性基因（R）与无毒基因（Av）非亲和互作，介导侵染部位的过敏性坏死反应 （Hypersensitive Response,HR） 和细胞程序性死亡 （Programmed Cell Death，PCD），从而阻止病原菌的定殖和扩展[3]；另一种是由多个基因（Quantitative Trait Loci,QTL） 控制的数量抗性，属于非小种专化性，并且无法介导HR 反应，该类型对疫霉菌病原体具有广谱抗性， 但抗性较弱。 目前，质量抗性为研究的重点[8]。

3.4.2 PRR 抗源筛选 抗性资源的筛选是防治PRR 的基础，也是抗性研究的关键。 我国拥有丰富的大豆种质资源，安徽、四川、湖北、江苏存在的抗性资源较多[39]。 南方的大豆种质抗性优于北方，江苏、河南、安徽的抗病资源更为丰富，黄淮海地区的抗性种质资源最多[40-42]。 李永刚等用游动孢子接种法，利用7 个菌株对生产上常用的51 个大豆品种进行鉴定，对所有7 种供试毒性型均具有抗性的有9 个，占17.6%，均感病的有2 个，占3.9%[43]。任海龙等采用下胚轴伤口接种法用大豆疫霉菌株Pm14 对南方部分地区江西、 湖南和广西的273 份野生大豆资源进行筛选， 其中3.30%表现为抗病，16.48%表现为中间反应类型[44]。 程艳波等采用下胚轴创伤接种法，利用大豆疫霉菌PGD1 菌株鉴定华南省份631 份大豆种质资源对PRR 的抗性， 分析出能够同时抗7 个不同毒力的大豆疫霉菌株的4 份种质[45]。 黄婧通过224 份大豆微核心种质对14 个菌株的抗性研究发现，有18 份种质拥有最广抗谱，能抗8～11 个不同的菌株[46]。杨晓贺等通过对13 个主栽品种进行大豆疫霉菌1 号小种的盆栽接种和大田接种抗性分析试验， 发现合丰55 和垦丰16 具有良好的抗性，是适合三江平原地区种植的抗PRR 的优良品种[47]。 刘淼等利用离体叶片接种法对黑龙江省的620 份野生大豆资源进行大豆疫霉菌1 号、3 号和4 号生理小种的抗病性鉴定，获得双抗资源23 份、三抗资源4 份[48]。

3.4.3 PRR 抗性基因发掘 目前国内外已发现分别定位在9 条染色体上的30 个抗病基因：Rps1、Rps7、Rps9、the WaseshirogeRps gene、RpsYD25、RpsYD29、RpsUN1、RpsWY和RpsQ定位于3 号染色体；Rps2和RpsUN2定位于16 号染色体；Rps3、Rps8和RpsSN10定位于13 号染色体；Rps4、Rps5、Rps6、Rps12和RpsJS定位于18 号染色体；Rps10定位于17 号染色体；Rps11定位于7 号染色体；RpsYB30定位于19 号染色体；RpsZS18定位于2 号染色体；RpsSu定位于10 号染色体[49]。

R 蛋白、转录因子（Transcription Factors,TF）和小RNA 都能介导疫霉的抗性， 其中R 蛋白中的NBSLRR 基因基本上都聚集在Rps 位点上， 因此推测NBS-LRR 基因可能与抗PRR 有关。 Rps2 位点富含9 个NBS-LRR基因，从Rps1k 位点分离出4 个CCNBS-LRR型同源基因，Rps1k-1和Rps1k-2转基因大豆植株能介导对大豆疫霉菌的抗性[50-51]。 与抗病相关的转录因子有WRKY 家族、MYB 家族、HSP 蛋白等， 其中WRKY 家族是主要的转录因子。 在高抗PRR 品种绥农10 中，GmWRKY31 能与GmHDL56 共同作用调控抗病基因GmNPR1 的表达从而提高抗性[52]。 将一个新的乙烯响应因子GmERF5 过表达，能够增强转基因大豆对疫霉菌的抗性[53]。 小RNA 包括miRNAs 和siRNAs，miRNA 参与大豆对大豆疫霉菌所有的抗病类型[54]，在大豆被侵染的根中由于热失活诱导产生的miR393 和miR166 共同参与大豆的基础防御反应[55]。 另外gma-miR1507a 能通过调节靶基因GmRGA4的表达来调控大豆对大豆疫霉菌的抗性[56]。小RNA 在大豆抗疫霉根腐病中也起着重要的作用，为大豆抗性育种提供了新的方向。

4 展望

PRR 对大豆生产危害性极大， 虽然目前对病症的研究愈加重视，但仍有许多问题需要解决。 农业生产方面的防治工作主要是加强田间管理和利用一些杀菌剂，但生产上工作量繁重，杀菌剂药效期有限，并且传统育种上的常规方式防治病害缺陷较大。 因此近些年越来越多的研究倾斜于基因育种。 栽培抗性大豆是其中一种防治措施， 通过遗传学分析已定位、鉴定出30 个抗性位点基因，并且对于抗性的基因组学、小RNA 及蛋白质组学方面也进行了深入的研究。 还有一个重要的工作是基因功能验证，由于大豆遗传转化较难，主要是利用大豆发状根转化、VIGS和CRISPR/Cas9 体系进行基因功能鉴定， 遗传转化系统需要更加稳定、高效。目前PRR 抗性研究的瓶颈主要是关于基因组学、遗传学、分子生物学、代谢组学、蛋白质组学、小RNA 及表观遗传组学等方面共同串联， 植物激素传导及代谢通路的调控网络也很复杂，需要进一步深入研究。