淫羊藿活性成分抗卵巢癌作用机制研究进展

李敏，刘芳媛，丁丹妮，韩凤娟✉

（1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

卵巢癌是威胁女性健康最常见的三大妇科恶性肿瘤之一［1］。流行病学调查显示，卵巢癌发病率占所有女性恶性肿瘤的2.5%［2］，但由于早期阶段患者未见明显的临床症状，超过70%的女性首诊即为卵巢癌晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）［3］，因此其病死率高，是妇科癌症死亡的首要原因［4］。关于卵巢癌的治疗一直是国际范围内的热点问题，虽然手术治疗、铂类药物化疗和靶向治疗等手段不断发展［5］，但在治疗过程中均会出现不同程度的药物不良反应，且患者五年生存率在40%左右，未见明显改善［6］，其病死率呈上升趋势［7］。中医药能够增强卵巢癌放化疗疗效，减少不良反应，延长患者生存期，提高生存质量［8］，为晚期卵巢癌患者提供了更多选择。

淫羊藿味辛、甘，性温，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之效。本研究团队认为“肾阳虚衰，血瘀于胞”是卵巢癌的发病机制，其中阳气虚衰是卵巢癌发病的根本原因［9］。淫羊藿温煦肾阳、扶助相火，以达到治疗卵巢癌的目的。黑龙江中医药大学附属第一医院王秀霞教授创制的验方“理冲生髓饮”中重用淫羊藿，实验研究发现理冲生髓饮能够抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移［10-11］。

目前从淫羊藿中提取到出明确具有抗卵巢癌活性的有效成分有淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷Ⅱ［12-14］。本文就淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷Ⅱ的抗卵巢癌研究现状和作用机制进行综述，以期为其治疗卵巢癌的深入研究提供参考依据。

1 促进卵巢癌细胞凋亡

细胞凋亡是由多种基因严格控制，多条信号通路协同参与的一种细胞死亡方式，是机体维持自身新陈代谢有序进行的重要生理机制。内源性线粒体凋亡是细胞凋亡发生的重要途径之一。当细胞内部受到信号刺激时（如细胞氧化应激、DNA 损伤、细胞生长因子缺失等），Bcl-2 家族蛋白通过改变线粒体外膜通透孔，通过控制线粒体通透性调节细胞凋亡［15］，如Bax 通过在线粒体膜上打孔增加线粒体膜通透性，是促凋亡因子；而Bcl-2 插入线粒体膜减少线粒体膜通透性，是抑凋亡因子。当线粒体膜通透性改变，线粒体中Cyt C的释放及Caspase级联反应，促使Caspase-9的活化和进一步激活Caspase-3 或Caspase-7，从而引起细胞凋亡［16］。

LI等［14］采用流式细胞术和Caspase-3比色法观察在0、13、25、50 μmol/L 淫羊藿苷作用下的卵巢癌A2780 细胞凋亡情况，结果发现A2780 细胞发生明显凋亡且呈剂量依赖性，其凋亡的机制可能通过抑制Bcl-2蛋白表达，诱导了Caspase-3的活性，启动细胞凋亡的内在途径来实现。淫羊藿苷可抑制多种人卵巢癌细胞系的增殖，如A2780 细胞、SKOV3 细胞和SKVCR 细胞，通过下调Bcl-2 水平，上调Caspase-3表达诱导卵巢癌细胞的凋亡［17-18］。研究发现，淫羊藿素可以同时调控促凋亡因子Bax和抑凋亡因子Bcl-2，发挥线粒体途径凋亡的作用［19］。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路是卵巢癌患者肿瘤组织中异常活跃的信号通路，也是抑制卵巢癌细胞凋亡的关键通道之一［20］，参与卵巢癌线粒体途径凋亡。PI3K 接受上游信号如多种生长因子和信号传导复合物被激活，被激活的PI3K 产生第二信使PIP3，促使Akt 蛋白磷酸化［21］。活化后的Akt 导致下游的一系列反应，如调节Bcl-2 蛋白的活性，抑制卵巢癌细胞线粒体途径凋亡［22］。同时Akt 直接或间接磷酸化mTOR。而mTOR 是负责细胞内核糖体生成的重要调控因子，在细胞增殖中发挥关键作用［23］。

PTEN 是PIP3-磷酸酶，通过将PIP3 去磷酸化发挥与PI3K 相反的功能［22］，是PI3K/Akt信号通路的负调控因子，被称为“抑癌基因”。侯科名等［24］将人卵巢癌细胞SKOV3 细胞接种于6 孔板，37 ℃培养过夜，之后以5、10、20 μmol/L 浓度的淫羊藿素处理48 h，通过流式细胞术检测发现不同浓度淫羊藿素组SKOV3 细胞凋亡率较空白对照组显著上升。同时，利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法进行检测，结果表明淫羊藿素处理过的SKOV3细胞中PTEN 基因表达较空白组明显上升，而PI3K、Akt 基因表达与之相反，且呈浓度相关性下降，蛋白印迹（Western blot）实验结果也予以佐证。淫羊藿素可以通过抑制PTEN 表达的方式调控PI3K/Akt信号通路，从而达到促进细胞凋亡的目的。

野生型p53 是重要的卵巢癌抑制基因［25］，与Akt/mTOR信号通路密切相关。p53可与Akt/mTOR 信号通路中蛋白结合，激活Akt活性［26］。淫羊藿素在40 μmol/L浓度下可以诱导卵巢癌顺铂敏感细胞OV2008、C13*和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780 的凋亡，并且以时间依赖的方式增加卵巢癌细胞中p53 的磷酸化，抑制Akt 和mTOR 的磷酸化，以上研究表明淫羊藿素介导的卵巢癌细胞凋亡与p53的激活和Akt/mTOR的抑制有关［27］。

2 影响卵巢癌细胞的侵袭与转移

卵巢癌细胞向周围组织侵袭和远处组织转移的恶性行为，是其与良性肿瘤的主要区别，直接影响卵巢癌预后的重要因素。淫羊藿苷通过抑制癌细胞的侵袭和转移，从而可以控制卵巢癌细胞的生长［28］。

2.1 抑制卵巢癌EMT

癌细胞借助上皮-间叶细胞转化（EMT）过程获得侵袭性和转移性，是肿瘤组织转移的关键渠道［29］。E-钙黏蛋白（E-cadherin）作为一种钙依赖型跨膜蛋白，其水平下降可以导致细胞的黏附力降低，中断细胞间的相互作用，使癌细胞获得易于侵袭和转移的特性［30］。N-钙黏蛋白（N-cadherin）是典型的成纤维细胞标志物。研究显示，术后病理组织中N-cadherin 高表达的卵巢癌患者更易触发癌细胞侵袭，在5 年的随访中临床复发率大约是N-cadherin 低表达患者的两倍［31］。波形蛋白（Vimentin）主要存在于各种间充质细胞内。作为间质细胞的标志物，Vimentin 增加意味着间质细胞表型的高表达。在EMT 过程中，Vimentin 与Snail、Slug、Twist 和ZEB1/2 等EMT 诱导剂的基因以及关键的表观遗传因子密切相关［32］。

李秋瑞等［33］经划痕实验及Transwell侵袭迁移实验发现，予以淫羊藿素5、10、20 μmol/L处理48 h后的卵巢癌细胞A2780 侵袭迁移数量和侵袭迁移率明显减少。与此同时，Western blot 与PCR 结果显示，E-cadherin 的蛋白和mRNA表达上升，N-cadherin、Vimentin表达水平总体下降。该研究提示淫羊藿素可通过阻止卵巢癌细胞EMT 的进程，减弱其迁移、侵袭能力，该作用呈浓度依赖性。在EMT 过程中，Akt/mTOR 信号通路已被证实发挥着不可忽视的诱导作用。Akt/mTOR 信号通路的磷酸化，激活EMT 诱导剂因子Snail、Slug、Twist 等在细胞核中的聚集，导致E-cadherin 表达下降［34］。淫羊藿素可以抑制Akt/mTOR 信号通路的磷酸化，增加E-cadherin 的表达，降低Vimentin 的表达，对顺铂敏感的卵巢癌细胞和顺铂耐药的卵巢癌细胞的迁移与侵袭具有明显的抑制作用［35］。

2.2 抑制卵巢癌侵袭与转移相关蛋白酶

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）被认为是癌细胞的侵袭与转移过程中重要的蛋白水解酶。肿瘤细胞的细胞外基质（ECM）与癌细胞基底共同构成肿瘤侵袭与转移的第一道生物屏障［36］。MMPs 能够降解ECM 中大部分蛋白成分的蛋白酶，影响细胞间黏附因子的效力，从而促进肿瘤细胞突破癌细胞基底和ECM，完成侵袭和转移［37］。MMPs有20多种，目前研究对MMP-2、MMP-9较为深入。MMP-2和MMP-9在水解ECM 这一物理屏障的同时，使得ECM 内部各种细胞因子（如VEGF、生长因子TGF-β、炎性因子IL-8）得以释放并活化［38-39］，进一步促进肿瘤血管的新生，为肿瘤组织的侵袭与转移提供营养支持和代谢通道。

研究发现，卵巢癌病理组织中的MMP-2、MMP-9经免疫组化SABC 三步法检测，均呈阳性表达，并且与卵巢癌患者的临床分期存在相关性［40］。进一步的研究显示，MMP-2 和MMP-9 在卵巢癌细胞中高表达，而敲除MMP-2 和MMP-9 可以减弱卵巢癌细胞的侵袭和迁移［41］。何泉［42］研究发现，淫羊藿苷对卵巢癌细胞SKOV3侵袭与转移能力的影响呈浓度相关性上升，通过RT-PCR 检测证明卵巢癌细胞中的MMP-2、MMP-9mRNA 表达随着淫羊藿苷剂量的增加而下降，因此淫羊藿苷可以通过抑制MMP-2、MMP-9 水平，从而影响卵巢癌细胞的侵袭与转移。

3 阻滞卵巢癌细胞周期

细胞周期的运行决定细胞增殖的速率，阻滞卵巢癌细胞的细胞周期可以有效地抑制卵巢癌的发展［43］。

3.1 靶向相关蛋白阻滞细胞周期

细胞周期的关键调节物质周期蛋白依赖性激酶（CDK）及调节其功能的细胞周期蛋白（Cyclin）共同推动细胞通过G1/S 期检查点进入DNA 的合成和G2/M期检查点开始有丝分裂［44-45］。Cyclin D1 和Cyclin E 是细胞周期G1/S期检查点调控蛋白，Cyclin B1蛋白是G2/M期检查点调控蛋白，均担任推动细胞通过检查点的调控作用［46］。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI，如p21、p16、p53等）与Cyclin相拮抗，抑制CDK的活性，维持细胞周期运行的动态平衡。Cyclin过度激活或抑制CKI活性均会打破了这种动态平衡［47-48］。p53能激活CKI1产生p21蛋白，抑制CDK-Cyclin磷酸化激酶活性，阻滞卵巢癌细胞周期运行［49］。

研究发现，25 μg/mL 的淫羊藿苷可以将SKOV3细胞阻滞在G2/M 期，抑制其增殖［50］。在用淫羊藿苷（1×10-6mol/L）处理过的SKOV3 细胞G1 期百分比上升，G2 期细胞无明显变化，S 期细胞显著下降，Cyclin D1 和Cyclin E 的蛋白质和mRNA 水平显著降低，p21蛋白和mRNA 表达上升，说明淫羊藿苷可以通过提高p21 水平，抑制CDK 和Cyclin 对SKOV3 细胞周期的调控作用，将细胞阻滞在G1期［51］。以20 μmol/L浓度的淫羊藿素处理过的p53野生型C13*细胞株的G1期百分比升高，Cyclin E蛋白表达下降，p53蛋白表达上升［52］，说明淫羊藿素可以靶向激活p53蛋白，使细胞中周期调节蛋白Cyclin表达下降，抑制卵巢癌细胞的生长。

3.2 调节Wnt/β-catenin信号通路阻滞细胞周期

Wnt/β-catenin 信号通路在肿瘤细胞的增殖、分化和转移中发挥重要作用［53］。通过Wnt/β-catenin 信号通路对下游细胞周期相关靶基因的激活，可促进卵巢癌细胞增殖［54］。β-catenin 是该通路上的核心蛋白分子，将信号从细胞质传递到细胞核。细胞外Wnt 配体蛋白与靶细胞膜上的Wnt 受体蛋白结合，从而激活细胞内相关蛋白，β-catenin 降解复合物的降解活性得以抑制，游离状态的β-catenin 在细胞质中不断蓄积并最终入核，与转录因子结合，刺激下游诸多靶基因，如c-myc、Cyclin D1、survivin 的转录［55］。而c-myc、Cyclin D1、survivin 均是细胞增殖和细胞周期的调控因子。淫羊藿苷能够降低Wnt/β-catenin 通路中β-catenin 的表达，并且能够抑制其下游c-myc、Cyclin D1 的基因表达和蛋白水平，同时细胞增殖也受到抑制［51，56］。microRNAs是Wnt/β-catenin信号通路的重要调控因子。FU等［57］通过GSEA分析在用淫羊藿苷处理过的卵巢癌SKOV3细胞中，Wnt/β-catenin信号通路被显著下调，继而抑制该信号通路下游靶蛋白Cyclin D1 和survivin 的表达，使用miR-1-3p 抑制剂可以逆转淫羊藿苷对Wnt/β-catenin 通路的抑制，并且在BALB/C 鼠的卵巢癌组织中同样得以验证，说明淫羊藿苷通过上调卵巢癌中miR-1-3p 水平抑制Wnt/β-catenin 信号通路，从而阻滞Wnt/β-catenin 信号通路下游蛋白对细胞周期和细胞增殖的调控。

4 诱导卵巢癌细胞自噬

自噬有利于细胞在外界刺激中，通过利用溶酶体降解自身胞内蛋白和受损细胞器，维持自身稳态。自噬缺陷会影响DNA 损伤的正确修复和致癌因子的激活，导致卵巢癌的发生［58］。自噬激活有助于抑制卵巢癌的发生发展。mTOR 是调节自噬的重要因子。当细胞处于生长激素受限，营养缺乏状态下，Akt 调节mTOR 失能，AMPK 通过磷酸化TSC2，使mTOR 活性受到抑制，其下游的ULK1激活，活化的ULK1将Beclin-1磷酸化［59］，这是诱导自噬的重要条件。Beclin-1 是在哺乳动物中发现的第一个与自噬相关的基因。Beclin-1 和ATG-5 分别与其他蛋白形成复合物，促成自噬体的形成［60］。p62 表达往往与自噬活性呈负相关。在自噬体延伸阶段，p62能够连接LC3（公认的自噬标记物）和聚泛素化蛋白之间的桥梁，与新的自噬体膜结合，参与新的自噬体膜的形成［61］。YUAN 等［19］经Western blot 实验发现，经60 μmol/L 淫羊藿次苷Ⅱ处理SKOV3 细胞中Akt、mTOR、p62 表达下降，p-AMPKα、Beclin-1、ATG-5 表达较对照组上升，说明淫羊藿次苷Ⅱ激活自噬生成和自噬体的延伸。miRNA 也参与卵巢癌自噬的调节。当淫羊藿次苷Ⅱ与miR-144-3p 抑制剂结合处理SKOV3 细胞时表现出对自噬的抑制［19］。IGF2R 是Akt/mTOR 通路的上游调节因子，miR-144-3p 是IGF2R 的调节靶点。miR-144-3p 通过靶向IGF2R 抑制Akt/mTOR 通路参与自噬的调节。

5 促进卵巢癌细胞焦亡

不同于细胞凋亡的溶解性死亡途径，细胞焦亡是一种通过细胞不断膨胀变大致使细胞膜破裂和细胞内容物向细胞外微环境的释放，由此激发胞外炎症反应的一种程序性死亡方式［62］。细胞焦亡在恶性肿瘤中扮演着重要角色，参与肿瘤免疫微环境和激发抗卵巢瘤的免疫应答［63-64］。在经典的细胞焦亡途径中，NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin 等在细胞内感应到细胞压力信号（如感染、炎症、氧化应激等）后被激活，形成炎性小体，并将pro-caspase-1 切割成为具有活性的Caspase-1，Caspase-1 将继续切割pro-IL-1β，形成有生物活性的IL-1β 并释放在细胞外，扩大细胞外炎症反应，激发机体内的免疫应答［65］。

淫羊藿苷对卵巢癌的抗肿瘤作用部分是通过激活细胞焦亡实现的。氧化应激通过产生过多的ROS，破坏线粒体释放的DNA，激活NLRP3 等炎症小体，是引发细胞焦亡原因之一［66］。以淫羊藿次苷Ⅱ干预SKOV3细胞6 h后细胞内ROS含量显著增加。Western blot 实验发现，ROS 含量增加上调了SKOV3 细胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 等蛋白的表达［67］。以上研究证实淫羊藿次苷Ⅱ可以通过诱导卵巢癌氧化应激激活细胞焦亡以此拮抗肿瘤的发展。

6 结语与展望

目前淫羊藿活性成分对卵巢癌的研究主要在实验阶段，通过检测相关因子的活性、基因表达和蛋白水平，探索淫羊藿苷在促进卵巢癌细胞凋亡、影响卵巢癌细胞的侵袭和转移、阻滞卵巢癌细胞的细胞周期、诱导卵巢癌细胞自噬和促进卵巢癌细胞焦亡方面的作用机制，表明淫羊藿活性成分具有治疗卵巢癌的可能。2023年1月以淫羊藿素为主要成分的中药制剂淫羊藿素软胶囊被国家药监局优先审评批准上市，但其适用范围尚未涉及卵巢癌。将来在充实实验数据的同时，应积极开展淫羊藿素软胶囊治疗卵巢癌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验，拓宽淫羊藿素软胶囊的适用范围，发挥中国传统医药在抗卵巢癌治疗方面的优势，为卵巢癌患者的治疗提供新的选择。