甜酒曲发酵小米酒精饮料工艺优化及其品质分析

张 瑞，刘敬科，刘俊利, ，常世敏

（1.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所，河北石家庄 050000；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038）

小米又称谷子，是中国主要杂粮作物之一。它具有耐干旱、耐贫瘠的特点，能够缓解农业用水压力问题和解决干旱、半干旱土地资源利用问题[1]。《本草纲目》中记载，小米有“养肾气，去脾胃中热，益气，陈者苦寒，治胃热消渴，利小便”的功效[2]，且小米中的营养成分含量高于大米、小麦，并含有多种生物活性物质[3]，是很好的营养食品源。

在谷物饮料的生产中，微生物发酵是常用的一种加工方式[4]。谷物作为优良益生元，通过发酵可以增加谷物饮料中营养素的含量从而提高其营养价值，还可以提高谷物饮料的感官特性，使其产生特有的风味[5]。在国外，用小米发酵的饮料已有很长的历史，像尼日利亚和印度地区的传统本土饮料就是由小米发酵制作而成，这些饮料能够让人们在夏季保持凉爽并远离疾病[6-7]。在我国，对小米液体发酵食品研究主要集中在小米黄酒和小米醋上，利用酒曲或醋酸菌，通过固态或液态发酵工艺生产制成，但对以小米发酵的饮料进行研究的报道很少。

本文利用甜酒曲发酵开发出一种小米酒精饮料，对其活性成分和抗氧化能力进行测定并对其风味进行分析。本研究可以拓宽小米加工产品并提高小米利用率，也为开发以小米为原料的功能性食品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小米 市售；甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、没食子酸、芸香叶苷、3,5-二硝基水杨酸 上海易恩化学技术有限公司；氢氧化钠 上海沃凯生物技术有限公司；酚酞天津市大茂化学试剂厂；其他化学试剂均为分析纯。

AG285 电子天平 梅特勒-托利多上海仪器有限公司；WPL-125BE 电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；LB32T 手持糖度折光仪 广州市铭睿电子科技有限公司；Thermo Multifuge 3 Plus 高速台式离心机 美国赛默飞世尔科技公司；Agilent 1290-6470 液相色谱仪质谱仪 美国Agilent 公司；PEN3 紫外分光光度计 德国AIRSENSE 公司；AGILENT7890-5975C 气相色谱-质谱联用仪 恩特斯分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小米酒精饮料制作工艺流程 小米→浸泡→蒸煮→冷却→拌曲→发酵→离心→灌装→灭菌→成品

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 原料浸泡 称取筛选好无杂质的小米，浸泡8 h。捞出已浸泡好的小米，去掉多余水分。

1.2.2.2 蒸煮 冲洗好的小米按1:1.5 比例加水，蒸煮30 min。

1.2.2.3 拌曲 蒸熟的小米冷却至室温，置于密闭容器中，拌入1.0%安琪甜酒曲，拌匀压实，搭成“倒V”形的凹窝，密封好，放入恒温培养箱中进行发酵。

1.2.2.4 发酵 在30 ℃培养箱中培养3 d，使小米得到充分的发酵。

1.2.2.5 离心灭菌 将发酵好的小米培养物进行离心，转速4500 r/min，时间20 min。取清液灌装于玻璃瓶中，放入80 ℃的水浴锅中恒温灭菌30 min，密封装罐，将成品放在4 ℃冰箱中方便备用。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 确定甜酒曲添加量 小米经浸泡冲洗后按1:1.5 比例加水蒸煮30 min，分别拌入0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%甜酒曲，拌匀压实，密封好。放入30 ℃恒温培养箱中发酵3 d，以感官评分、可溶性固形物和总酸为指标，探究甜酒曲添加量对饮料的影响。

1.2.3.2 确定发酵时间 小米浸泡冲洗后按1:1.5比例加水蒸煮30 min，拌入1.0%甜酒曲，拌匀压实，密封好。放入30 ℃恒温培养箱中分别发酵2、3、4、5、6 d，以感官评分、可溶性固形物和总酸为指标，探究发酵时间对饮料的影响。

1.2.3.3 确定发酵温度 小米浸泡冲洗后按1:1.5比例加水蒸煮30 min，拌入1.0%甜酒曲，拌匀压实，密封好。分别放入28、30、32、34、36 ℃恒温培养箱中分别发酵3 d，以感官评分、可溶性固形物和总酸为指标，探究发酵温度对饮料的影响。

1.2.4 响应面优化试验 在单因素实验的基础上，以甜酒曲添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）为自变量，以综合评分为响应值，借助 Design Expert 10软件进行响应面优化，试验设计见表1。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 Factors and levels of the response surface test

1.2.5 小米酒精饮料感官评价 由10 名食品专业人员分别从色泽、气味、味道和组织状态4 个方面来进行评分，评分标准参考相关文献[8]，结合产品自身情况进行修改，具体感官评分标准见表2。

表2 小米酒精饮料感官评分标准Table 2 Sensory scoring criteria for foxtail millet alcoholic beverages

1.2.6 多指标综合法 以感官评分、总酸和可溶性固形物作为试验优化指标，采用多指标加权综合评分法对小米酒精饮料的加工品质进行综合评价[9]。为让指标有相同的贡献，将感官评分（a）、总酸（t）和可溶性固形物（s）的权重系数均设计为0.1，综合评分（Q）=感官评分×0.1+总酸×0.1+可溶性固形物×0.1。

1.2.7 基础指标测定

1.2.7.1 总酸测定 按照GB12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[10]。

1.2.7.2 可溶性固形物测定 按照GB/T 12143-2008《饮料通用分析方法》[11]。

1.2.7.3 酒精度测定 按照GB5009.225-2016《酒中乙醇浓度的测定》。

1.2.8 活性成分及体外抗氧化测定

1.2.8.1 矿物质测定 按照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[12]。

1.2.8.2 B 族维生素测定 称取样品2 mL，加入8 mL 1 mol/L 盐酸溶液，80 ℃水浴振荡30 min，过0.22 μm微孔滤膜后上机测定。

色谱条件：色谱柱：Agilent C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流速0.3 mL/min；流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为甲醇，洗脱比例：0 min 99:1、3.2 min 60:40、3.6 min 5:95、4.7 min 99:1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：35 ℃。

质谱条件：离子源（ESI）负离子电离模式；检测方式：多反应监测（MRM）模式；离子喷雾电压4000 V；离子源温度350 ℃；气体：氮气。

定量分析：根据每个B 族维生素标准品的浓度和出峰面积，计算样品含量。

1.2.8.3 黄酮含量测定 参考李若熙等[13]方法进行修改。取1 mL 样品，用60%乙醇补至5 mL 后加入0.3 mL 的5% NaNO2溶液，摇匀静置5 min。然后加0.3 mL 的10% Al（NO3）3溶液，静置5 min。加入2 mL 4% NaOH 溶液，用60%乙醇定容至10 mL，静置15 min 后在510 nm 波长处测定吸光度值，以芦丁为标准品，求得线性回归方程为Y=0.9779X+0.0017，R2=0.9991。

1.2.8.4 多酚含量测定 参考付依依等[14]方法进行修改。取0.5 mL 样品，加入0.5 mL 福林酚显色剂，摇匀后加入1.5 mL 的7.5% Na2CO3溶液，定容至10 mL，室温避光1 h 后在765 nm 波长处测定吸光度值，以没食子酸为标准品，求得线性回归方程为Y=13.49X+0.025，R2=0.9956。

1.2.8.5 DPPH 自由基清除率测定 参考鲍玉花等[15]的方法进行修改，制备0.2 mmol/L DPPH 工作液，取样品和DPPH 工作液各2 mL，混匀后避光静置30 min，在517 nm 处测定其吸光度A1；用乙醇代替样品测其吸光度为A2；用乙醇代替DPPH 工作液测其吸光度为A3。计算公式见公式（1）。

1.2.8.6 ABTS+自由基清除率测定 参考Huang等[16]的方法并进行修改，将7.4 mmol/L 的ABTS 溶液和2.6 mmol/L 过硫酸钾溶液1:1 混合，避光反应12 h，用无水乙醇稀释，其在734 nm 处吸光值0.70±0.02，为ABTS 工作液。取0.1 mL 样品和4 mL ABTS工作液，混匀后避光静置10 min，在734 nm 处测其吸光度B1；用乙醇代替样品测其吸光度为B2。计算公式见公式（2）。

1.2.8.7 羟基自由基清除率测定 参考鲍玉花等[15]的方法，依次加入样品、6 mmol/L 硫酸亚铁溶液、6 mmol/L 过氧化氢溶液和6 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液各2 mL，充分混匀后，37 ℃水浴30 min，于517 nm处测定吸光值为C1；用去离子水代替过氧化氢测其吸光值为C2；用去离子水代替样品测其吸光值为C3。计算公式见公式（3）。

1.2.9 挥发性风味物质测定

1.2.9.1 SPME 萃取方法 取4 mL 样品于萃取瓶中，加入10 μL 4-甲基-2-戊醇（2000 mg/L）内标。使用DVB/PDMS/PDMS 萃取头，萃取温度60 ℃，萃取时间40 min，于250 ℃解吸5 min[17]。

1.2.9.2 仪器条件 GC 条件：色谱柱：DB-5MS 毛细管气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度45 ℃保留2 min，再以4 ℃/min 升温到220 ℃保留5 min。载气为氦气，流速1.0 mL/min，不分流。

MS 条件：接口温度为250 ℃，电离方式为电子电离（Electron Ionization，EI），电子能量70 eV，灯丝发射电流为200 μA，离子源温度为300 ℃，扫描质量范围33～450 amu。

1.2.9.3 定性定量方法 定性分析：在相同GC 条件下分析C8～C20烷烃混合标准溶液，计算小米酒精饮料挥发性成分保留指数（Rentention Index，RI），通过与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）谱库的检索保留正反匹配度800 以上的物质，对比挥发性成分RI，进行定性分析。

定量分析：采用加入内标法对饮料挥发性成分进行定量分析，化合物浓度=（化合物峰面积/内标峰面积）×内标浓度。

1.3 数据处理

每个指标均做3 次重复实验，用Origin 2019 软件处理所得数据，单因素结果方差和显著性采用SPSS 20 软件进行分析，并应用Design-Expert 10 统计软件进行响应面优化处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 甜酒曲添加量对小米酒精饮料的影响 由图1可知，小米酒精饮料的感官评分呈先上升后下降趋势，在添加量为1.0%时达到最高，感官评分的最高分为87 分，此时饮料的色泽、形态、滋味和风味较好。从整体上看，可溶性固形物含量与总酸含量呈反比。当添加量＞1.0%时，感官评分逐渐下降，可能是因为甜酒曲添加过多，根霉菌生长过快而发生衰亡，使饮料的苦味较明显[18]，可溶性固形物转化成总酸的能力也随之下降。从综合评分上看，甜酒曲添加量在1.0%时分数最高。所以，综合考虑，选择甜酒曲的添加量为1.0%时作为响应面试验的“0”水平。

图1 甜酒曲添加量对小米酒精饮料的影响Fig.1 Effect of the addition amount of liqueur koji on the foxtail millet alcoholic beverages

2.1.2 发酵时间对小米酒精饮料的影响 由图2 可以看出，随着发酵时间的增加，总酸呈整体上升趋势，而可溶性固形物含量在发酵过程中逐渐减少，在第3 d 时感官评分达到最大值，然后逐渐降低。可能是因为发酵时间越长，发酵越彻底。在发酵过程中，微生物生长繁殖迅速，利用饮料中的可溶性固形物，将其转化成酒精、有机酸和其他风味物质[19]。同时，发酵时间的延长增强了发酵体系中产酸菌的活性，使饮料的酸味增加，甚至产生涩味和苦味，影响了饮料的整体风味。从综合评分上看，发酵时间为3 d 时分数最高。因此，选择发酵时间为3 d 时作为响应面试验的“0”水平。

图2 发酵时间对小米酒精饮料的影响Fig.2 Effect of the fermentation time on the foxtail millet alcoholic beverages

2.1.3 发酵温度对小米酒精饮料的影响 由图3 可知，发酵温度在28～34 ℃时，可溶性固形物整体呈下降趋势，总酸整体呈上升趋势，当发酵温度达到36 ℃时，可溶性固形物直线上升，而总酸直线下降，可能是因为米根霉的最适发酵温度在30～35 ℃范围内[20]，当根霉菌生长受到抑制后，可溶性固形物转化成酸性物质的能力也会降低。从感官评分上可以看出，温度在32 ℃时评分是最高的。从综合评分上看，发酵温度32 ℃时分数最高。综合考虑，选择发酵温度为32 ℃时作为响应面试验的“0”水平。

图3 发酵温度对小米酒精饮料的影响Fig.3 Effect of the fermentation temperature on the foxtail millet alcoholic beverages

2.2 响应面优化结果

在单因素实验的基础上，以综合评分为指标，采用Design-Expert 10 软件Box-Benhnken 法进行试验设计，确定饮料的最佳工艺，试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface experimental design and results

对表3 试验数据进行二次多项回归拟合，获得综合评分对甜酒曲添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）的多元回归方程为：Y=13.07+0.054A-0.15B+0.13C+0.057AB+0.025AC+0.18BC-0.24A2-0.62B2-0.40C2。

该模型的方差分析结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression model

以综合评分为评价指标，对模型进行统计学检验并分析，由表4 可知，该回归模型P＜0.01，极显著，失拟项P=0.3050＞0.05，不显著，说明方程能准确反映综合评分与各因素之间的关系。回归模型相关系数R2=0.9757，R2adj=0.9444，拟合程度良好。单因素B 极显著（P＜0.01），三因素的F值分别为1.97、15.52、11.29，因此，对小米酒精饮料综合评分影响大小的因素依次为发酵时间（B）＞发酵温度（C）＞甜酒曲添加量（A）。二次项A2、B2、C2对饮料的综合评分影响都极显著（P＜0.01）。

利用Design-Expert 10 软件对表4 的数据进行二元多次回归拟合，A、B、C 三个因素对综合评分（Y）的影响交互作用关系见图4。

图4 各因素交互作用对饮料综合评分影响的响应面图Fig.4 Response surface diagram of the interaction of each factor on the comprehensive score of beverages

2.3 模型验证实验

经Design-Expert 10 软件分析得出，在发酵工艺为甜酒曲添加量1.03%、发酵时间2.90 d、发酵温度32.28 ℃时，测得饮料的综合评分为13.09 分。考虑实际操作性，将工艺调整为甜酒曲添加量1%、发酵时间3 d、发酵温度32 ℃。在此工艺下进行验证实验，得出的饮料感官评分为89.37 分，可溶性固形物为22.05%，总酸为19.33 g/L，综合评分为13.08 分。与预测值的误差较小，在合理范围之内，所以此模型运用响应面优化得到的工艺具有可靠性。

2.4 小米酒精饮料酒精度

测得小米酒精饮料的酒精度为0.7%vol，GB/T 17204-2021 中提到酒精度在0.5%vol 以上的称为酒精饮料，说明该款饮料是小米酒精饮料。

2.5 发酵小米酒精饮料中活性成分及体外抗氧化能力

2.5.1 小米酒精饮料矿物质含量 矿物质是机体所必需的营养元素，对人体的正常发育至关重要，但是矿物质不能自身合成，需要不断地从食物中摄取。缺乏和过量摄入矿物质都会导致机体出现功能性障碍和紊乱，所以需要适当均衡的从饮食中摄取一定数量的必需矿物质，以维持机体正常的生命活动[21]。如表5 所示饮料中矿物质含量由高到低依次为钾＞镁＞钙＞锌＞锰＞硒。钾是所有元素中含量最高的元素，与之前的研究一致[22]。

表5 小米酒精饮料中矿物质元素含量Table 5 Mineral element content in foxtail millet alcoholic beverages

2.5.2 小米酒精饮料B 族维生素含量 B 族维生素通常以辅酶或辅助因子的形式参与脂肪、蛋白质、碳水化合物等的代谢过程，对维持机体的健康生长起到积极作用[23]。但B 族维生素易受到环境的影响，在加工制备过程中可能造成一部分B 族维生素的流失[24]。从表6 中可以看出，饮料中含有431.36 μg/L的烟酰胺。烟酰胺是维生素B3 进入人体后转化的物质，除具有抗氧化、美白的功效外，对视网膜神经节细胞也有较强的保护作用[25]。小米酒精饮料中B 族维生素含量由高到低依次为烟酰胺＞维生素B6＞泛酸＞维生素B1＞维生素B2＞烟酸。

表6 小米酒精饮料中B 族维生素含量Table 6 B vitamin content in foxtail millet alcoholic beverages

2.5.3 小米酒精饮料黄酮、多酚及抗氧化能力分析 如表7 所示，该饮料的黄酮含量为66.78 mg/L，多酚含量为65.13 mg/L。研究表明，酚类、黄酮类等营养成分在抗氧化过程中起到了重要的作用[26]。通过测定DPPH 自由基、ABTS+自由基及羟自由基清除率来检测其抗氧化活性，结果显示小米酒精饮料具有一定的抗氧化活性，该饮料的DPPH 自由基及羟自由基的清除率均较高于彭新颜等[27]研究的褐色乳饮料，可以得出此款饮料的抗氧化活性总体较高。

表7 小米酒精饮料黄酮、多酚及抗氧化能力Table 7 Flavonoids,polyphenols and antioxidant capacity of foxtail millet alcoholic beverages

2.6 小米酒精饮料挥发性风味物质分析

利用SPME/GC-MS 对饮料挥发性成分进行分析，从表8 中可以看出，共检测到46 种挥发性成分，其中包括14 种酯类、3 种酸类、11 种醇类、8 种醛类、5 种酮类和5 种其他类物质。研究表明，小米中挥发性成分主要集中于醛类物质，苯乙醛、反-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛等这几种醛类物质是小米自有的挥发性香味成分[28]。经甜酒曲发酵后可以看出酯类、醇类、醛类种类最多，是饮料中的主要挥发性物质，这与龚燕川等[29]探究不同品牌醪糟挥发性成分所得的结果一致。

表8 小米酒精饮料挥发性风味物质分析Table 8 Analysis of volatile flavor substances in foxtail millet alcoholic beverages

2.6.1 酯类物质 酯类物质一般是由醇类物质酯化产生，具有水果甜香或花香气味[30]。饮料中酯类物质最多，以乙酯类和丙酯类的饱和酯类物质为主，它们主要呈现水果香、花香、酒香和脂香等。乙酸异戊酯、正己酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯这几种酯类物质在小米酒精饮料中含量相对较高，说明这几个酯类成分可能对饮料香气具有重要贡献。

2.6.2 醇类物质 醇类物质也是饮料中主要挥发性物质之一，大部分的醇类物质都是由酒精发酵阶段产生的，而且醇类是生成酯类物质的前体物质。在饮料中可以看出，正己醇、3-甲硫基丙醇、1-辛醇是含量最多的醇类物质，含量分别为112.75、153.78、122.87 μg/L，它们主要贡献的风味为果香、花香和草木香等。1-壬醇有橙子和玫瑰香气，1-辛烯-3-醇有蘑菇、玫瑰和甘草香气，这些醇类赋予饮料鲜香醇厚的特征香气，对饮料香气的形成有促进作用[31]。

2.6.3 醛类物质 醛类物质主要来自于氨基酸的代谢或不饱和脂肪酸的氧化[32]，不同的氨基酸在相应的酶作用下可产生不同的醛类物质，它们能协调各香气组分，促进其释放。在饮料中，影响其风味最重要的醛类化合物是苯甲醛，其含量最高，具有苦杏仁、樱桃的香味。

3 结论

本文以小米为原材料，通过加入甜酒曲发酵研制出一款谷物酒精饮料，并对其营养品质和挥发性风味物质进行评价。实验结果表明，发酵工艺的最优条件为：甜酒曲添加量1%、发酵时间3 d、发酵温度32 ℃。该谷物酒精饮料酒精度为0.7%vol，还富含多种生物活性成分，且DPPH、ABTS+和羟自由基清除率分别为73.19%、34.29%、53.72%，说明该饮料具有较好的抗氧化能力。利用SPME/GC-MS 对饮料挥发性成分进行分析，共检测到46 种挥发性成分，这些成分构成小米酒精饮料特有的风味。该研究为开发以小米为原料的功能性食品提供理论依据，为实现农产品资源的深度开发开辟有效途径。

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