应用低温等离子技术灭活体外结核分枝杆菌效果的初步研究

薛莲 剧猛 黄毅 赵国连 张语豪 王思翰 雷颖 党丽云 左蕾

结核病仍然是当前严重危害人类健康的主要传染病之一,杀灭结核分枝杆菌是预防及控制结核病的重要内容之一[1-2]。结核分枝杆菌生命力顽强,且不易被控制[3],特别是发生在肺部及皮下组织内的局限性结核病灶不易治疗,随着耐药结核病的传播,此类局限性结核病灶的治疗尤为困难[4]。有研究报道,采用抗结核药物配合局部消融治疗具有一定的效果[5-6],但仅局限于微波、射频及激光等消融方法,而低温等离子消融技术相较于其他消融方法具有低温、反应轻、疗程短及无明显疼痛等优点,目前已应用于咽喉部疾病及椎间盘突出等疾病的治疗[7-10]。但低温等离子技术对于不同结核分枝杆菌是否具有杀灭作用、杀灭所需时间及杀灭效果等鲜有报道。本研究通过体外实验探讨低温等离子技术对不同耐药类型结核分枝杆菌的杀灭效果,旨在为结核分枝杆菌的杀灭提供新的技术方法。

材料和方法

一、实验材料

1.菌株:结核分枝杆菌标准株(H37Rv;来源于中国疾病预防控制中心室间质评下发菌株)、广泛耐药结核分枝杆菌(extensive drug-resistantMycobacteriumtuberculosis,XDR-MTB)菌株、耐多药结核分枝杆菌(multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis,MDR-MTB)菌株。XDR-MTB与MDR-MTB菌株来源于临床患者,采用中和基因法由BACTEC MGIT 960系统(美国BD公司)进行分枝杆菌液体培养,再用胶体金标记的MPB64蛋白(杭州创新生物检控技术有限公司)单克隆抗体试剂进行抗原检测为MTB复合群,使用微孔板MIC法进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)最终确定。

2.试剂:分枝杆菌培养液(美国BD公司)、分枝杆菌营养添加剂(美国BD公司)、罗氏固体培养基(珠海市银科医学工程股份有限公司)。

3.仪器:PLA-600等离子体手术系统及MC247等离子刀头(直径0.9 mm/长度20 cm;成都美创电子科技有限公司);5 ml无菌试管;10 μl接种环(型号:65-0010,美国Biologix公司);PhoenixSpec比浊仪(美国BD公司);微生物培养箱(型号:SPX-250C;常州中诚仪器制造有限公司);生物安全柜(型号:BSC-1500∥A2-X,中国Biobase公司)。

二、研究方法

1.菌悬液的制备:取多个罗氏固体培养基培养3周以内的H37Rv、XDR-MTB(临床分离株)、MDR-MTB(临床分离株)新鲜菌落,经超声分散仪分散后配置0.5麦氏浓度的菌悬液,后倍比稀释为3×104菌落形成单位(colony forming units,CFU)/ml试验用菌悬液备用。

2.等离子体手术系统调节:将低温等离子系统档位调节至9档(平均功率9 W),安装等离子刀头,采用PLACOAG(止血、凝固)模式,此模式平均输出功率范围为0～350 W,其通过100 kHz的射频电场,激发电解液在电极周围形成含大量带电粒子的等离子体薄层,产生能量打开靶组织细胞的分子键。

3.试剂分组:将实验用菌悬液分为6组,1个对照组和5个实验组,为减少实验误差,每组设计2份平行样本,实际试验样本量为对照组2份样本量,实验组10份样本量。

4.低温等离子实验方法:于生物洁净安全柜内,分别取2.0 ml 3×104CFU/ml菌悬液样品置于无菌试管中,调节等离子刀头约距离试管底部10 mm后对其进行处理。将刀头垂直放入装有菌悬液的5组实验组试管中央,作用时间分别为3、6、9、12、15 s,每次刀头在试管内作用后,均经过含有75%酒精的无菌纱布擦拭充分灭菌。为防止气溶胶的产生,实验开机前需于试管口等离子刀头旁使用棉球防止气溶胶逸散。

5.菌落培养:低温等离子实验完毕后,即将实验组及对照组试验用菌悬液吸取10 μl接种于罗氏培养基上,置37 ℃培养箱培养21 d后计算菌落数。各时间点重复上述操作等离子体处理,处理后取样测定菌落数量。

三、观察指标

分别计算上述3种结核分枝杆菌菌悬液在低温等离子不同作用时间点的菌落数,分别计算并比较3组结核分枝杆菌菌悬液在不同作用时间点的各组杀菌对数值及杀菌率。杀菌对数值=对照组平均活菌量对数值―实验组平均活菌量对数值;杀菌率=(对照组平均活菌量―实验组平均活菌量)/对照组平均活菌量×100%。

四、统计学处理

结 果

一、3种菌株行低温等离子不同作用时间的杀菌对数值比较

H37Rv菌株(F=20.313,P=0.003)、XDR-MTB菌株(F=13.956,P=0.006)及MDR-MTB菌株(F=20.355,P=0.006)不同作用时间杀菌对数值差异均有统计学意义;3种菌株均于作用15 s时杀菌对数值达到最大值。3种菌株在作用9 s时杀菌对数值比较差异有统计学意义(F=61.603,P=0.004),其中XDR-MTB菌株最低,H37Rv菌株居中,MDR-MTB菌株最高;在作用12 s及15 s时3种菌株比较杀菌对数值差异均无统计学意义(F=1.383,P=0.375;F=8.301,P=0.060)。见表1。

表1 3种不同结核分枝杆菌行低温等离子消融不同处理时间的杀菌对数值比较

二、3种菌株行低温等离子不同作用时间的杀菌率比较

H37Rv菌株(F=10.458,P=0.012)、XDR-MTB菌株(F=10.945,P=0.011)及MDR-MTB菌株(F=9.424,P=0.015)不同作用时间杀菌率差异均有统计学意义;3种菌株均于作用15 s时杀菌率达到最大值。3种菌株在作用9 s时杀菌率差异有统计学意义(F=287.890,P<0.001),其中XDR-MTB菌株最低,H37Rv菌株居中,MDR-MTB菌株最高;3种菌株于作用12 s和15 s比较,杀菌率差异均无统计学意义(F=1.264,P=0.400;F=0.805,P=0.525)。见表2,图1。

注 XDR-MTB:广泛耐药结核分枝杆菌;MDR-MTB:耐多药结核分枝杆菌

表2 3种不同结核分枝杆菌行低温等离子消融不同处理时间的杀菌率比较

讨 论

由于结核分枝杆菌特有的细胞壁成分,其生命力持久,不易被消灭[11],发生在肺部及皮下组织内局限结核病灶的治疗尤为困难。化学消毒剂对皮肤黏膜具有强烈的刺激性,不宜用于临床治疗[12];而药物配合局部微波或射频消融治疗具有一定疗效,但消融区产生的局部高温具有明显灼热疼痛感[13-14]。因此,寻找一种有效、无明显疼痛的治疗方法已成为临床研究的重要方向。

本研究通过体外实验证实了低温等离子技术对H37Rv、XDR-MTB及MDR-MTB均具有快速且明显的灭活效果。H37Rv、MDR-MTB从作用3 s时菌落数均明显减少,在作用15 s时杀菌率可分别达到99.26%和100.00%。而XDR-MTB于作用9 s时菌落数明显减少,与H37Rv、MDR-MTB菌组比较,XDR-MTB杀菌率在作用12 s、15 s时明显升高,在作用12 s以后差异无统计学意义,在作用15 s可达到96.35%,意味着对于XDR-MTB,需要更长的作用时间方能提高杀菌率。

结核分枝杆菌对高温具有一定的耐受力[15],且微波和射频等热消融会引起患者不同程度的疼痛感[16-17],冷冻消融最低温度为―196 ℃,单个循环时间为5～15 min[18],患者会出现冷休克风险。低温等离子消融是将射频刀头与组织之间的电解液转化成50～100 μm厚度的等离子薄层,强大的电场使等离子薄层中的带电粒子获得足够动能,从而打断靶组织分子键,使靶组织细胞裂解、萎缩、破坏,继而脱落[7-10],其单个循环持续时间一般为15 s,并可将温度精确控制在40～70 ℃,其热损伤深度为0.5 mm,对正常邻近组织的创伤很小[10],因此更适用于邻近重要组织脏器、血管、神经及位于浅表的病灶,患者的治疗时间短,疼痛感轻,且不易发生皮肤灼伤。本研究通过体外实验表明,低温等离子消融技术对上述3种结核分枝杆菌仅需要15 s就能达到显著的杀灭效果,通常情况下结核分枝杆菌对高温具有一定的耐受能力,在62～63 ℃高温需持续15 min,或100 ℃需要5 min才能杀灭[19]。因此,考虑低温等离子消融对结核分枝杆菌的杀灭作用为高速运动的离子动能打断靶组织的分子键,从而快速引起病菌结构的破坏和损伤,达到杀灭病菌的目的,而非完全依赖于温度的改变,其具体的作用机制还有待于进一步的研究。

本研究结果表明,低温等离子技术对3种常见结核分枝杆菌均具有快速且有效的杀灭作用,并且随着作用时间的延长,其杀菌率也逐渐升高,且3种不同结核分枝杆菌的杀灭效果在不同作用时间有所不同,因此需要制定个体化的策略。

本研究存在一定局限性,本次研究仅是通过体外试验证实了低温等离子技术对3种类型结核分枝杆菌具有快速、明显的杀灭效果,但还缺乏相应的杀菌原理的实验验证,其他的影响因素,以及其在在体实验是否具有相同的杀灭效果等。因此,下一步将考虑行局部结核分枝杆菌感染性病灶的低温等离子在体动物实验,探讨其治疗效果、影响因素及治疗机制,以期为结核性病变的临床研究及治疗提供一种新的技术方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献薛莲和剧猛:酝酿和实验设计、实施研究、采集数据、起草文章、支持性贡献;赵国连、张语豪、王思翰和雷颖:采集数据、实施研究、协助整理数据;黄毅、党丽云和左蕾:酝酿和实验设计、获取研究经费、行政/技术或材料支持、分析/解释数据、对文章的知识性内容作评价性审阅、指导、支持性贡献