高效液相色谱-质谱联用法测定血浆中异烟肼及其代谢物浓度的研究

葛菲 朱慧 程凯 陆宇 徐建

异烟肼通过抑制细菌细胞壁的合成,能有效地阻止结核分枝杆菌的生长和繁殖,作为一线抗结核药品被广泛应用于结核病的治疗。异烟肼的代谢被认为与异烟肼介导的肝损伤相关。异烟肼通过氧化代谢途径产生的乙酰肼和肼为其主要的毒性代谢物,它们较母药更易造成肝损伤,其体内暴露量与肝损伤明显相关[1]。因此,对异烟肼及其代谢物乙酰肼和肼进行血药浓度监测,有助于实施临床个体化给药,减少药物不良反应的发生。

目前,检测肼类化合物的方法主要有气相色谱法[2]、高效液相色谱法(HPLC)[3]、气相色谱-质谱法[4]和高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)[5-8]。临床应用中,常用于检测异烟肼血药浓度的方法主要是HPLC[9-10]。相较于其他方法,HPLC-MS/MS在靶向定量分析领域具有高敏感度、高选择性、宽线性范围、高准确性和重现性等显著优势。依托质谱技术,HPLC-MS/MS能够准确识别目标化合物并进行定量分析,适用于复杂样品的分析,并拓宽了仪器分析范围,为临床治疗药物监测提供了可靠的数据支持,被广泛应用于药物代谢动力学、生物样品分析等领域[11-14]。但已报道的方法存在前处理流程复杂、不能实现异烟肼及其代谢物同时检测等问题。因此,仍需要探索更简单灵敏的方法,可以同时测定人体血浆中的异烟肼及其代谢物乙酰肼和肼。本研究基于HPLC-MS/MS技术,以异烟肼-D4作为同位素标记内标,建立了快速、灵敏,可同时检测血浆中异烟肼及其代谢物乙酰肼、肼浓度的分析方法,并对校准曲线、线性范围、准确度、精密度、回收率、基质效应、稳定性进行了方法验证;同时,应用该方法对临床104例肺结核患者进行了异烟肼及其代谢物的治疗药物监测,以期为临床用药提供指导。

材料和方法

一、材料

1.仪器:UltraLC 110 液相串联API 4000 Q-trap 型液-质联用系统(美国AB Sciex公司);电子分析天平(德国赛多利斯公司,BS110S);漩涡混合器(上海清甫仪器有限公司,SHA-C型);高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司FRESCO21型离心机);超声波水浴清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

2.试剂:异烟肼(美国Sigma公司,批号:MKBW9046V);乙酰肼[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,批号:P8GWL-NT];肼(美国Sigma公司,批号:MKBV0553V);异烟肼-D4(南京昊绿生物科技有限公司,批号:YYJ0434314TR-HLM);色谱纯甲醇(美国赛默飞世尔科技公司,批号:204132);色谱纯乙腈(美国赛默飞世尔科技公司,批号:F21LA7202);对甲基苯甲醛(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C10298201);甲酸(北京迪科马科技有限公司,批号:2142969);甲酸铵(美国Honeywell公司,批号:I2740);乙酸(上海吉至生化科技有限公司,批号:A331384C9)。

3.样品来源:患者来源于首都医科大学附属北京胸科医院,年龄范围18～60岁,确诊肺结核,并接受规范抗结核治疗。服用异烟肼的剂量为1次/d,每次300～500 mg,于服药后2 h采集静脉血4 ml,4 ℃ 条件下,3000×g离心10 min,取上层血浆放入-80 ℃冰箱内保存备用。共收集104例肺结核患者的血浆样本。本研究得到了首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会的批准(批准号:YJS-2022-16号),所有受试者在试验前均签署了知情同意书。

二、方法

1.色谱条件:采用InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm);柱温

为30 ℃;自动进样器温度为4 ℃;流动相A为含0.1%甲酸和5 mmol甲酸铵的水溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱:0～2 min,95% A;2～3 min,95% A～5% A;3～5.5 min,5% A;5.5～6.5 min,5% A～95% A;6.5～8 min,95% A;运行时间8 min;进样量5 μl;流速0.4 ml/min。

2.质谱条件:质谱采用电喷雾离子源(ESI),以多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式扫描,正离子模式检测。电喷雾电压:5500 V;离子源温度:500 ℃;入口电压、出口电压分别设置为10 V、10 V;气帘气(CUR):30 psi;雾化气(GS1):50 psi;加热气(GS2):50 psi。待测物及内标异烟肼-D4衍生物的MRM参数见表1。

表1 高效液相色谱-质谱联用法的多反应监测参数设置

3.溶液配制:(1)精密称取异烟肼、乙酰肼、肼的对照品适量,用甲醇分别配制成浓度均为1 mg/ml的单一成分标准品储备液,-80 ℃避光保存。(2)精密量取异烟肼-D4溶液100 μl于25 ml量瓶中,用甲醇定容,即得质量浓度为100 ng/ml的内标工作溶液。(3)精密量取对甲基苯甲醛2 ml于100 ml量瓶中,加入9.8 ml乙酸,用甲醇定容,即得质量浓度为20 μg/ml的对甲基苯甲醛溶液。

4.标准溶液配制:以甲醇稀释待测物储备液,配制系列浓度的线性混标工作溶液,混标工作溶液Line 1～Line 8中各待测物浓度分别为:(1)异烟肼:1、2、5、10、20、60、100、120 μg/ml;(2)乙酰肼:0.5、1、2.5、5、10、30、50、60 μg/ml;(3)肼:20、40、100、200、400、1200、2000、2400 ng/ml。

取空白血浆95 μl,加入5 μl混标工作液Line 1～Line 8,各待测物在血浆中分别为:(1)异烟肼:50、100、250、500、1000、3000、5000、6000 ng/ml;(2)乙酰肼:25、50、125、250、500、1500、2500、3000 ng/ml;(3)肼:1、2、5、10、20、60、100、120 ng/ml。

5.质控样本工作液配制:各待测物浓度分别为:(1)异烟肼:1、3、50、90 μg/ml;(2)乙酰肼:0.5、1.5、25、45 μg/ml;(3)肼:20、60、1000、1800 ng/ml。

取空白血浆95 μl,加入5 μl混标工作液,各待测物在血浆中浓度分别为:(1)异烟肼:50、150、2500、4500 ng/ml;(2)乙酰肼:25、75、1250、2250 ng/ml;(3)肼:1、3、50、90 ng/ml。

6.血浆样品处理:将待分析的血浆样品在室温下解冻,解冻完全后使用涡旋混合器将样品充分混匀。取100 μl血浆加入350 μl甲醇,50 μl内标异烟肼-D4储备液(100 ng/ml),涡旋混匀后,12 000×g离心10 min,取上清100 μl加入300 μl衍生化试剂对甲基苯甲醛溶液,充分混匀后室温超声反应40 min,取200 μl置于进样瓶中,上机进样分析。

三、统计学处理

结 果

一、方法建立及验证

1.专属性考察:通过对比空白血浆基质、空白血浆基质+待测物混合对照品工作溶液(定量限浓度)+内标和临床患者血浆+内标的MRM色谱图,判断体内存在的其他内源性物质是否影响待测物的浓度测定,考察HPLC-MS/MS分析方法的专属性。结果显示,在本实验确定的检测条件下,样品中的内源性物质不影响待测物及内标的分离测定,且待测物与内标峰形良好。待测物与内标的MRM色谱图见图1。

注 图A:空白血浆;图B:空白血浆+待测物混合对照品工作溶液(定量限浓度)+内标;图C:临床患者血浆+内标;MRM:多反应监测

2.线性范围考察:配制每个浓度的标准曲线样品,进行处理后,进样分析,记录色谱图、待测物的峰面积(As)及内标的峰面积(Ai)。以浓度(C)为横坐标,待测物与内标峰面积的比值(As/Ai)为纵坐标作回归方程,权重系数为1/X2,结果如表2所示。异烟肼在线性范围50～6000 ng/ml内线性良好,乙酰肼在线性范围25～3000 ng/ml内线性良好,肼在线性范围1～120 ng/ml内线性良好,决定系数(R2)均>0.99。

表2 高效液相色谱-质谱联用法测定异烟肼、乙酰肼和肼的线性范围、决定系数和定量限

3.残留:制备异烟肼、乙酰肼、肼定量上限(ULOQ)样品,质量浓度分别为4500、2250、90 ng/ml。在每条标准曲线ULOQ样品后立即进行空白样品分析,考察高浓度样品残留对测定的影响从而计算残留效应。结果表明,空白样品中异烟肼、乙酰肼、肼的信号响应强度分别不超过定量下限(LLOQ)的0.12%、1.33%和2.06%,异烟肼-D4的信号响应强度不超过LLOQ的0.06%。

4.准确度与精密度:制备4个浓度的标准血浆样品溶液各6份,进行HPLC-MS/MS分析,考察分析方法的批内精密度和准确度。在不同时间连续制备并测定3个分析批次,考察方法的批间精密度和准确度。精密度用质控样品的批内和批间相对标准差(relative standard deviation,RSD)表示,准确度用相对误差(relative error,RE)表示。结果显示,异烟肼、乙酰肼、肼的批内和批间精密度RSD均≤11.76%,准确度RE绝对值均≤6.43%,符合生物样品检测的限度要求(精密度RSD<15%,准确度RE绝对值<15%)。具体见表3。

表3 高效液相色谱-质谱联用法测定化合物的准确度和精密度结果

5.回收率和基质效应:取空白血浆100 μl,处理操作后得到空白基质,加入混合对照品工作溶液5 μl,制备未经提取的低、中、高3个浓度的对照样品各6份,制备供试溶液,记录各待测物峰面积(At);取空白血浆95 μl,加入混合对照品工作溶液5 μl,配制成低、中、高浓度的标准血浆样品各6份,进行前处理,记录各待测物峰面积(AS);用起始比例流动相代替空白血浆,同上述方法制备相应浓度的溶液各6份,记录各待测物峰面积(AB)。

按As/At×100%计算提取回收率。结果显示,异烟肼、乙酰肼、肼的提取回收率均≥85.72%,RSD均≤6.02%(表4),符合生物样本测定要求。按At/AB×100%分别计算待测物和内标的基质效应。内标归一化基质效应=待测物基质效应/内标基质效应×100%。结果显示,异烟肼、乙酰肼、肼的内标归一化基质效应为86.05%～111.96%,RSD均≤9.18%(表5),符合生物样本测定要求(基质效应在85%～115%,RSD<15%)。

表4 高效液相色谱-质谱联用法测定化合物的提取回收率

表5 高效液相色谱-质谱联用法测定化合物的基质效应结果

6.稳定性:取空白血浆配制低、中、高质控样品各3份,分别考察含药血浆样品室温放置24 h、4 ℃冷藏24 h、-80 ℃冻存7 d、-80 ℃冻存14 d、反复冻融3次的稳定性及血浆样品处理后在进样仓放置24 h的稳定性。结果表明,待测物在各种条件下放置后,浓度无明显变化,说明在上述条件下稳定性良好(表6)。

表6 高效液相色谱-质谱联用法测定化合物浓度的稳定性

二、临床应用

用上述方法检测104例肺结核患者血浆中异烟肼及其代谢物。根据随行标准曲线计算样本中待测物的浓度。异烟肼的浓度范围为359.41～5866.71 ng/ml,乙酰肼的浓度范围为667.11～2997.79 ng/ml,肼的浓度范围为4.38～112.66 ng/ml(表7)。

表7 高效液相色谱-质谱联用法检测临床血浆样本中异烟肼、乙酰肼、肼的浓度

讨 论

最近,一项病例对照研究显示,异烟肼与药物性肝损伤之间存在明确关联,这再次强调了在异烟肼治疗期间进行治疗药物监测的必要性[15]。事实上,近年来异烟肼诱导肝毒性的潜在机制受到广泛关注。越来越多的证据表明,其毒性代谢物的形成触发肝毒性和肝细胞凋亡[16-17]。本研究开发并验证了一种新的HPLC-MS/MS方法,用于同时定量人血浆中的异烟肼及其毒性代谢物乙酰肼和肼,并成功应用于临床,这将为异烟肼的药物警戒提供支持。

目前已有关于采用HPLC-MS/MS检测异烟肼的研究报道,这进一步证实了该方法在临床应用中分析异烟肼的有效性和可行性[18-20]。文献中对异烟肼的检测往往与其他抗结核药物同时进行,而同时检测异烟肼的代谢物并未受到足够关注。既往研究中在检测异烟肼血药浓度的同时也同时检测了代谢物乙酰异烟肼,但未检测其毒性代谢物乙酰肼和肼的血药浓度[18-19]。Gao等[20]研究中,建立了4种一线抗结核药物同时检测的方法,但异烟肼的定量范围较窄,而临床中所用剂量不同和个体差异会导致药物浓度范围更宽。

本研究建立的HPLC-MS/MS法具有以下优势:(1)本方法不仅可以检测异烟肼,还能同时分析与药物性肝损伤有关的代谢物乙酰肼和肼,为异烟肼的治疗药物监测提供了更全面的支持。(2)本方法采用同位素内标具有出色的分辨率和高度准确的检测能力,能够有效地分离和鉴定异烟肼及其代谢物,从而确保结果的准确性和可靠性。(3)本方法能够在更宽的浓度范围内检测异烟肼及其代谢物,提高了方法的适用性和可靠性。

由于乙酰肼和肼的弱保留性,通常很难通过HPLC-MS/MS直接检测,故采用衍生化法对乙酰肼和肼进行前处理后进行分析,以提高检测性能。文献中报道的异烟肼及其代谢物的血药浓度测定方法将异烟肼与乙酰肼和肼分开检测,采用不同的前处理方法和分析方法,这大大增加了前处理及分析的流程和时间[8]。本研究将异烟肼、乙酰肼和肼同时进行衍生化,成功实现了异烟肼及其代谢物乙酰肼和肼在同一前处理条件下的同时测定。

本研究选择对甲基苯甲醛为衍生化试剂,对待测物进行衍生化,并对衍生化条件进行了摸索和优化;选择室温超声作为反应条件,考察了不同反应时间(10、20、30、40、50 min)对信号响应的影响,选择最佳反应时间为40 min。针对待测物经对甲基苯甲醛衍生化后,在HPLC-MS/MS分析时存在衍生反应还未到反应终点问题,影响了定量结果的准确性和稳定性的问题,本研究采取加大衍生化试剂对甲基苯甲醛的用量,并于衍生化反应体系中加入适量乙酸,使反应进行完全。在反应过程中引入超声波以提高分子碰撞的概率,从而提高反应产率。与加热衍生化方法相比,超声水浴可以获得微米和纳米级的聚集体,缩短反应时间,提高反应效率[21]。通过使用超声波,本研究的样品预处理流程简单,无需额外的加热和纯化程序。

此外,同位素内标与目标分析物具有相似的理化性质,能够显著减少待测样品的基质效应等因素对测定结果的影响,从而提高回收率和方法的稳定性,还可以校正预处理引入的偏差和进样系统中的误差导致的数据偏离[22]。文献中异烟肼代谢物的血药浓度测定普遍采用外标法[7]及惰性内标法[8]进行定量,这些方法均有一定的局限性。本研究选用异烟肼同位素标记物异烟肼-D4对异烟肼、乙酰肼、肼进行内标法定量,实验结果表明,以异烟肼-D4作为内标,基质对检测结果的影响较小,提取回收率均>85%,且具有较高的准确度和重现性。

异烟肼是目前广泛应用于结核病治疗的抗结核药物之一。然而,其代谢物存在潜在的肝毒性,这一点在临床应用中需要引起高度重视。本研究检测了异烟肼给药后2 h临床血浆样本中异烟肼及其代谢物乙酰肼和肼的浓度水平,结果显示,患者体内的异烟肼和代谢物乙酰肼和肼的浓度存在较大的个体间差异。Song等[7]检测了异烟肼末次给药24 h后患者体内异烟肼及肼的浓度,结果表明,长期服用异烟肼后,患者体内残留有乙酰肼和肼。而乙酰肼和肼的残留量在不同患者中差异较大。因此,需要对临床服用异烟肼的患者进行血药浓度监测,对于血药浓度明显增高的患者,需要密切关注其药物不良反应情况;而对于血药浓度偏低的患者,建议医生调整给药剂量。临床应结合患者的个体特征和治疗目标,从疗效和肝毒性两方面考虑,制订最佳的个体化给药方案,适当调整异烟肼剂量,以达到最佳的治疗效果。

对于服用标准剂量异烟肼的患者,异烟肼的推荐峰值浓度(Cmax)为3～6 mg/L[23-24],若Cmax<2 mg/L,可增加异烟肼剂量,若Cmax>6 mg/L,则提示可能会有肝损伤风险,应密切关注肝功能情况。在本研究中,组内各检测指标数值差异较大,目前尚无确定的代谢物正常值参考范围。同时,关于什么浓度可以提示对肝脏有损伤及是否停药的指导作用的问题,需要更多的临床数据和病例支持才能做出准确的结论。由于笔者目前缺乏肝损伤患者的病例数据,尚无法得出明确的结论,因此,会在接下来的研究中收集相关数据,以便更全面地分析和探讨这些问题。

综上所述,本研究建立了一种快速灵敏的HPLC-MS/MS方法,可用于测定人体内异烟肼及其代谢物乙酰肼、肼的血药浓度,通过对方法专属性、标准曲线、精密度、准确度、基质效应、回收率和稳定性等的验证,本研究建立的方法准确度高、专属性强,已应用于异烟肼及其代谢产物的临床监测。该方法有助于临床优化异烟肼的个体化给药,从而减少异烟肼引起的肝损伤的发生。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献葛菲:酝酿和设计实验、实施研究、起草文章、统计分析;朱慧:采集数据、分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导;程凯:分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、支持性贡献;陆宇:分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、行政/技术/材料支持、指导;徐建:酝酿和设计实验、分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持、指导