基于HPLC测定黄柏不同炮制品中黄柏碱与小檗碱的含量

杨永乐 胡振宇 阿丽牙·阿布来提 叶喜德

1万年县中医院质控科，上饶 335500；2江西中医药大学药学院，南昌 330004

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮，树皮内层经炮制后入药［1］。依照其来源，可分为川黄柏和关黄柏［2］。黄柏首载于《神农本草经》，又名“檗木”，列为上品，其味苦，寒，无毒，随后历代本草均有记载［3］。黄柏具清热解毒、泻火燥湿之功效，主要用治火热毒邪气、湿热等证，临床应用广泛［4-8］。其主要生物活性成分为生物碱，包括小檗碱、巴马汀、药根碱和黄柏碱等［9-12］。其中小檗碱、巴马汀、药根碱为抗病原微生物的有效成分，而黄柏碱则具有降压作用［13-15］。此外，黄柏还具有调节免疫功能、强心、抗溃疡等作用［16-17］。目前，对黄柏的研究多数集中在成分分析和药效研究，鲜有基于炮制方法开展其主要有效成分差异性的研究报道［18-22］。黄柏炮制方法较多，主要有盐炙、酒炙和炒炭等［23-24］。由于不同炮制方法存在辅料、加工方法和炮制程度的差异，这势必会影响药材的质量与疗效。黄柏碱与小檗碱是黄柏的主要有效成分，也是发挥药效的关键因素。因此，本研究以黄柏为原药材，采用不同炮制方法制备不同炮制品，建立黄柏碱与小檗碱的含量测定方法，并在同一条件下比较黄柏不同炮制品之间的含量差异，为其深入研究提供参考。

仪器与试药

1.药品

黄柏原药材（产自安徽汇仁堂中药饮片有限公司）经江西中医药大学刘应蛟副教授鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendron amurenseRupr.的干燥树皮。黄柏碱（批号：wkq21031209，纯度≥98%）、小檗碱（产品批号：20233011，纯度≥98.96%）均由成都克洛玛生物科技有限公司提供。

2.仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪（VWD检测器，安捷伦仪器有限公司），昆山-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA1004N 1000000电子天平（上海精密科学仪器有限公司），TDL-80-2C低速离心机（上海安翔科学仪器厂）。

3.试剂

乙腈（色谱纯，含量≥99.9%，格瑞斯化工科技有限公司），甲醇（色谱纯，格瑞斯化工科技有限公司），甲酸（色谱纯，含量≥98.0%，天津市大茂化学试剂厂），双蒸水（自制）。

方法与结果

1.色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm，Dikma）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（磷酸调至pH=2.5），梯度洗脱：0～5 min，90%乙腈；6～14 min，79%乙腈；15～22 min，70%乙腈；流速：1.0 ml·min-1；运行时间：22 min；柱温：25 ℃；检测波长：284 nm；进样量：20 µl。理论塔板数根据2020年版《中华人民共和国药典》［1］计算，黄柏碱峰结果＞6 000，小檗碱峰结果＞4 000。

2.溶液的制备

2.1.对照品储备液的制备 精密称量黄柏碱1.09 mg、小檗碱1.07 mg，分别加甲醇10 ml，稀释，制备成对照品储备溶液，冷藏，备用。

2.2.混合对照品溶液的制备 精密量取黄柏碱储备液30 µl、小檗碱储备液150 µl，加甲醇定容至10 ml，超声提取15 min，得黄柏碱为0.032 mg·L-1和小檗碱为0.178 mg·L-1的混合对照品溶液，0.22 µm微孔膜过滤，得滤液，待测。

2.3.供试品溶液的制备

2.3.1.黄柏不同炮制品的制备 （1）生黄柏：取原药材，洗净，浸润，待药材软化切成丝，即得。（2）盐黄柏：称取1.0 g食盐，加适量纯净水溶解后滤过，放置一旁备用。然后取50.0 g干燥黄柏丝放入滤过后的盐水中拌匀，稍闷，待盐水被吸尽后，置入炒制容器内，用文火加热，不断翻炒，待表面炒干后取出放凉，筛去碎屑，即得。黄柏与食盐比例为50∶1。（3）酒黄柏：取黄柏生品50.0 g，于一定比例黄酒浸润，闷透，置入炒制容器内，用文火加热至表面棕黄色时，取出放凉，筛去碎屑，即得。黄柏与黄酒的比例为10∶1。（4）黄柏炭：取黄柏生品50.0 g，置热锅内，武火加热至表面焦黑色，内部焦黄色时取出，喷洒少许清水，晾干，筛去碎屑，即得。

2.3.2.黄柏样品制备 精密称取生黄柏、盐黄柏、酒黄柏、黄柏炭粉末各1 g，研磨成细粉，分别装入15 ml EP 管中，加入5.5 ml 50%甲醇溶液，摇匀，待溶剂被吸收后，超声提取30 min，取出，3000 r·min-1离心（离心半径为14.7 cm）10 min，倾取上清液，放入10 ml 容量瓶中，连续反复提取2 次，合并上清溶液，用0.22 µl 微孔滤膜过滤，得黄柏不同炮制品样品溶液，分别保存在4 ℃冰箱内，待测。

3.方法学考察

3.1.专属性考察 精密吸取“2.2.”项中混合标准溶液5 µl，根据“1.”项色谱条件进行检测。黄柏碱和小檗碱色谱峰见图1，结果表明，黄柏碱和小檗碱分离和峰型良好。

图1 黄柏不同炮制品中黄柏碱和小檗碱的高效液相色谱法（HPLC）图

3.2.线性关系考察 精密吸取“2.2.”项中混合对照品溶液5 µl，根据“1.”项色谱条件进行检测。以峰面积积分值（Y）、注射量（X）进行线性回归方程，计算得回归方程，分别得黄柏碱Y=17.65X+35.97，R2=0.999 2，线性范围0.354～0.760 g·L-1；小檗碱Y=846.54X+18.92，R2=0.999 9，线性范围3.865～7.530 g·L-1。黄柏碱与小檗碱成分的线性关系考察结果见图2，结果表明黄柏碱和小檗碱具有良好线性关系。

图2 混合对照品溶液中黄柏碱（A）与小檗碱（B）线性关系考察结果

3.3.精密度试验 精密吸取“2.2.”项中混合对照品溶液5 µl，反复取样6 次，得高效液相色谱法（HPLC）色谱图。计算得黄柏碱、小檗碱峰面积的相对标准偏差（RSD）值分别为0.90%、0.70%，RSD≤2%，结果表明，该法精密度良好。见表1。

表1 混合对照品溶液中黄柏碱与小檗碱的精密度试验结果（6份）

3.4.重复性试验 精密吸取“2.3”项中生黄柏供试品溶液，设为3 组，每组2 份，共6 份，上样测定，得各样品HPLC色谱图。利用出峰时间和峰面积计算可知，黄柏碱、小檗碱峰面积RSD 值分别为2.50%、1.30%，RSD≤3%，说明该法重复性良好。见表2。

表2 生黄柏供试品溶液中黄柏碱与小檗碱重复性试验结果（6份）

3.5.稳定性试验 精密吸取“2.3”项中生黄柏供试品溶液常温下静置，于0、3、6、9、12、24 h取样检测，得HPLC色谱图，黄柏碱与小檗碱峰面积RSD 值分别为1.50%、0.29%，RSD≤2%，说明生黄柏供试品溶液在常温环境下静置24 h稳定性良好。见表3。

表3 常温下静置不同时间的生黄柏供试品溶液中黄柏碱与小檗碱稳定性试验结果

3.6.加样回收试验 称取同一供试品6 份（生黄柏），每份精密称定1.0 g，将一定量黄柏碱和小檗碱对照品溶液分别加入每份供试品中，按“2.3”项方法制备，测定并计算加样回收率，黄柏碱和小檗碱的回收率分别为99.84%、99.97%，RSD 分别为0.40%、0.17%，说明该法回收率良好。见表4、表5。

表4 生黄柏供试品黄柏碱加样回收试验结果（6份）

表5 生黄柏供试品小檗碱加样回收率考察结果（6份）

4.样品测定

精密吸取已制备好的4 种黄柏炮制品供试品溶液，根据“1.”项色谱条件进样检测，每组炮制品种进样3 次，计算黄柏碱与小檗碱的含量，见表6。结果表明黄柏不同炮制品中黄柏碱和小檗碱含量差异较大，黄柏碱含量由低到高顺序为：黄柏炭＜黄柏生品＜盐黄柏＜酒黄柏；小檗碱含量由低到高的顺序为黄柏炭＜盐黄柏＜黄柏生品＜酒黄柏。

表6 4种黄柏炮制品供试品溶液黄柏碱与小檗碱的含量测定结果

讨论

黄柏为一味常用中药，其性寒，味苦，具清热燥湿、泻火解毒、除骨蒸之功效，临床常用治湿热泻痢、黄疸尿赤、带下阴痒、湿疹湿疮等证［25］，所含小檗碱、黄柏碱、药根碱等生物碱类成分具有抗菌、消炎、利尿、抗心律等多种药效作用［26］，易受外界环境的影响而发生变化［27］。因此，不同炮制方法对其化学成分影响的差异性较大，进而影响药材质量。从成分研究来看，黄柏药材中小檗碱含量相对较多，常作为评价药材质量的关键指标［28-29］。但由于许多药材，如黄连、三颗针等均含有该成分［30-31］，故评价黄柏药材质量及优选优质的炮制品，常选择两种或两种以上的有效成分进行研究。为此，本研究选用黄柏碱和小檗碱作为检测指标，以比较黄柏不同炮制品之间的含量差异，目的是探讨不同炮制方法对药材质量的影响。

为确保本研究方法准确、可靠，实验对流动相条件进行了优化。研究比较了3 种不同系统的分离效果，即乙腈-水溶液、乙腈-50%甲醇溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸调至pH=2.5），结果表明乙腈-水流动相系统洗脱能力不足，样品分离度不如乙腈-50%甲醇溶液洗脱能力好；甲醇溶液洗脱能力较强，但峰型比乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸调至pH=2.5）差；综合比较后发现，以乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸调至pH=2.5）为流动相所得样品峰形及分离程度最好，可有效防止拖尾现象发生［32］。因此，本研究以乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸调至pH=2.5）作为流动相。

对于检测波长，小檗碱波长常选择345 nm，虽然其在该波长范围内灵敏度较高，但对黄柏碱的灵敏度不高［12］。而选择220 nm 设为检测波长时，虽然有利于黄柏碱的检测，但小檗碱的灵敏度较低，吸收波长明显变短。经过对比发现，两者在284 nm 波长范围灵敏度较高，故以284 nm 为检测波长。本研究结果表明，黄柏经不同方法炮制后，其主要成分黄柏碱和小檗碱含量会发生较大变化，其中酒炙品含量最高，而经炒炭后2 种成分含量均明显降低，说明黄柏化学成分受加工炮制的影响。推测可能是由于黄酒为弱有机溶剂，黄柏酒炙后能增加生物碱的溶解度而增高其含量。而黄柏炒炭后，经过长时间高温加热，黄柏碱和小檗碱发生成分转化而含量降低。因此，不同炮制方法会对黄柏的主要有效成分黄柏碱和小檗碱含量产生影响，且有可能影响药效。但这种成分含量的变化，如何影响药效及其作用机制仍未完全阐明，希望本文能为深入研究黄柏提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明杨永乐：酝酿和设计试验，实施研究，文章撰写，获取研究经费，行政；胡振宇：分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析；阿丽牙·阿布来提：采集数据，起草文章；叶喜德：技术或材料支持，指导，支持性贡献