不同农业改良措施对老参地土壤酶活性及微生物群落的影响

刘莹 孙文松 李玲 李旭 王新雅 刘兵

摘要：连作障碍是限制人参产业高质量发展的关键因素。通过不同改良措施对老参地土壤养分、土壤酶活性及土壤微生物种类丰富度的影响研究，解析不同农业措施对连作人参地的改良作用机制。本研究以轮作水稻、杀菌剂+高温闷地、高温闷地、淹水等为处理，以老参地不处理土壤为对照，测定了土壤基础理化指标、酶活及土壤微生物，并分析了其间的相关性。结果表明，与对照相比，不同处理均对土壤养分、土壤酶活性和微生物多样性产生不同程度影响，综合多指标分析结果表明，轮作水稻改良效果突出，提高了老参地土壤过氧化酶活性、中性磷酸酶活性、脲酶活性，增加了土壤真菌多样性，降低了多酚氧化酶活性。相关性分析结果表明，土壤多酚氧化酶与速效氮呈显著正相关，微生物多样性真菌ACE指数、Chao1指数、香农指数均与脲酶活性呈正相关，其中ACE指数、Chao1指数呈显著水平，而香农指数呈极显著水平，细菌Chao1指数与多酚氧化酶活性呈显著正相关。老参地轮作水稻，这项改良措施通过提升多种土壤酶活性及微生物丰富度能够起到改良土壤的作用，为老参地土壤改良提供有效措施和理论基础。

关键词：人参；连作障碍；土壤养分；改良措施；土壤酶活；土壤微生物

中图分类号：S567.5⁺10.6；S154.3  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）06-0235-07

收稿日期：2023-04-06

基金项目：辽宁省应用基础研究计划（编号：2022JH2/101300284）；辽宁省农业科学院协同创新“揭榜挂帅”专项（编号：2022XTCX0503）；国家现代农业产业技术体系建设专项；辽宁省科技厅乡村振兴联合计划（编号：2021JH2/10200044）；辽宁省科技厅创新平台建设项目（编号：2021JH13/10200007）。

作者简介：刘莹（1986—），女，辽宁灯塔人，博士，副研究员，主要从事中药材育种与栽培研究。E-mail：357237261@qq.com。

通信作者：孙文松，硕士，研究员，从事中药材资源收集与利用、中药材新品种选育及绿色生态栽培技术研究。E-mail：sunwensong12@126.com。

人参（Panax ginseng）是多年生草本植物，连年种植人参的土地俗称老参地，人参忌地性极强，一般认为老参地需要经过33年以上的休耕还林才能再种参，老参地如未经改良处理直接栽参极易导致病虫害多、出苗率低、须根褐变腐烂等问题^[1]。目前除野山参及林下抚育栽参外，生产上都是采用伐林栽参模式，然而由于伐林栽参易破坏大量的森林资源，造成严重的水土流失，生态环境失衡等问题，因此伐林栽参并不能长久之计。同时，随着我国退耕还林、平原绿化、天然林保护三大工程的实施，已明令禁止开垦林地栽参，致使人参主产区辽宁、吉林、黑龙江等东北三省适宜栽参的土地严重不足，因此，老参地土壤改良是目前人参产业发展中迫切需要解决的首要问题之一。此前，国内外学者研究认为人参连作制约因素主要有：（1）土壤理化性质劣变；（2）土壤微生物群落变化，人参根际土壤中细菌和放线菌数量连年减少，真菌数量连年增多，有益菌数量减少；（3）根际周围自毒物质不断积累聚集土壤微生态环境发生劣变，影响植株正常代谢，最终产生连作障碍^[2-11]。本研究通过各种调控措施轮作、淹水、高温闷地等方式对老参地进行改良，着重研究不同改良措施对老参地土壤养分、酶活性及微生物群落结构影响，以期为老参地改良提供理论基础和技术支撑，进而促进东北参业可持续健康发展。

1  材料与方法

1.1  供试材料

试验在抚顺新宾县长沙村连续（2014—2018年）种植人参的老参地进行，前茬为玉米，土壤为黄壤土。

1.2  试验设计

2019年开展老参地土壤处理，试验共设置7个处理，处理1：轮作水稻（5月移栽水稻，按常规管理）；处理2：杀菌剂+高温闷地，5月末6月初施用多菌灵杀菌剂（苏农生物科技有限公司，用量为 1 500 g/hm²）后旋耕深翻35 cm，浇透水后覆盖黑地膜，9月撤掉地膜，再次旋耕并裸晒1周，以备人参播种（移栽）；处理3：高温闷地，5月末6月初旋耕深翻35 cm，浇透水后覆盖黑地膜，9月撤掉地膜，再次旋耕并裸晒1周，以备人参播种（移栽）；处理4：对照，老参地不做任何处理；处理5：淹水3个月；处理6：淹水2个月；处理7：淹水1個月。随机区组设计，重复3次，每个小区面积20 m²。

1.3  测定项目和方法

2019年9月10日分别采集试验地各试验小区土壤样品，采用5点采样法采集耕层（0～30 cm）土样50 g，去除杂质后进行混匀，用5 mL取样管盛装3 mL土壤样品并置于干冰中运输至实验室，将样品保存于-80 ℃冰箱用于测定微生物多样性；同样采用5点采样法采集耕层（0～30 cm）土样500 g，自然风干后研磨，过60目筛用于土壤理化性质及土壤酶活测定。

1.3.1  土壤化学性质测定

土壤酸碱度（pH值）通过pH计（梅特勒Seven2Go）测定，土壤有机质含量采用K₂Cr₂O₇容量法测定，土壤有效氮含量利用碱解扩散法测定，土壤有效磷含量的测定采用NaHCO₃-钼锑抗分光光度法，土壤速效钾含量的测定利用乙酸铵（CH₃COONH₄）浸提法。

1.3.2  土壤酶活性测定

土壤酶活试剂盒购于北京索莱宝公司，各种酶活性的测定根据试剂盒说明书进行，其中参照脲酶活性检测试剂盒（BC0120，北京索莱宝科技有限公司）说明书测定脲酶活性；参照过氧化氢酶活性检测试剂盒（BC0100，北京索莱宝科技有限公司）说明书测定土壤过氧化氢酶活性；参照土壤中性磷酸酶活性检测试剂盒（BC0465，北京索莱宝科技有限公司）说明书测定中性磷酸酶活性；参照土壤多酚氧化酶活性检测试剂盒（BC0115，北京索莱宝科技有限公司）说明书测定土壤多酚氧化酶活性。

1.3.3  土壤微生物的测定

土壤微生物多样性测定委托北京百迈客生物科技有限公司，提取土壤总DNA后，利用末端带有测序接头的特异性引物进行PCR扩增、纯化、定量及均一化构建小片段文库，再用Illumina NovaSeq 6000进行测序，通过Reads进行拼接、聚类及去噪，进行丰度分析。

1.4  数据分析与处理

土壤微生物数据系统分析使用北京百迈客生物科技有限公司。用SPSS 17.0进行单因素方差分析及多重比较，使用Excel 2013进行数据处理及制图。

2  结果与分析

2.1  不同改良措施对老参地土壤养分及土壤酶活的影响

2.1.1 土壤养分

从表1可以看出，经不同改良措施处理后土壤理化性状发生改变。与对照相比，轮作水稻、杀菌剂+高温闷地处理土壤pH值提高至7.58、7.63，高温闷地处理土壤pH值显著降低，为7.02；淹水处理1个月显著降低土壤pH值，随着淹水时间延长，pH值显著上升，淹水3个月处理土壤pH值为8.43，显著高于对照。与对照相比，除杀菌剂+高温闷地和轮作水稻处理外，各处理均提高了土壤有机质含量；除杀菌剂+高温闷地处理外，各处理均降低了有效磷含量。与对照相比，轮作水稻、杀菌剂+高温闷地处理显著降低了土壤速效氮含量，高温闷地处理显著提高了速效氮含量，比对照高17.75%；淹水1个月、淹水2个月处理速效氮含量与对照相比显著降低4.40%、2.27%，但淹水处理3个月处理速效氮含量比对照显著提高4.45%。各处理土壤速效钾含量均降低，排序为对照＞淹水3个月＞淹水1个月＞高温闷地＞淹水2个月＞杀菌剂+高温闷地＞轮作水稻处理。

2.1.2  土壤酶活性

不同土壤样品的酶活性见图1，轮作水稻土壤过氧化氢酶活性最高，显著高于其他处理，高于对照37.70%，杀菌剂+高温闷地、高温闷地处理分别高于对照12.11%、0.67%。另外，过氧化氢酶活性随着淹水时间的延长而降低，淹水1个月和淹水2个月分别比对照增大10.92%和5.92%。而淹水3個月比对照降低了9.66%。不同改良技术对土壤过氧化氢酶影响大小排序为轮作水稻＞杀菌剂+高温闷地＞淹水1个月＞淹水2个月＞高温闷地＞对照＞淹水3个月处理。

不同土壤改良措施对土壤中性磷酸酶活性影响较大。轮作水稻土壤中性磷酸酶活性仍然最高，显著高于对照15.70%，杀菌剂+高温闷地、高温闷地处理分别高于对照1.55%和5.88%。另外，中性磷酸酶活性随着淹水时间的延长同样也降低，淹水1个月和淹水2个月处理分别比对照增大7.27%和0.39%。而淹水3个月比对照降低了0.62%。不同改良技术对土壤中性磷酸酶活性影响大小排序为轮作水稻＞淹水1个月＞高温闷地＞杀菌剂+高温闷地＞对照＞淹水2个月＞淹水3个月处理。轮作水稻、淹水1个月、高温闷地中性磷酸酶活性增加，与对照差异显著；杀菌剂+高温闷地和高温闷地之间，以及与对照、淹水2个月和淹水3个月处理间差异不显著。

不同土壤改良措施对土壤脲酶活性影响差异显著。轮作水稻土壤脲酶活性最高，显著高于对照3.03%；淹水3个月最低，比对照减小了9.76%。其他4个处理（杀菌剂+高温闷地、淹水1个月、高温闷地和淹水2个月）脲酶活性均低于对照，分别减少了1.92%、4.73%、5.28%和8.14%。

同样，不同土壤改良措施对土壤多酚氧化酶活性影响差异显著。轮作水稻处理土壤多酚氧化酶活性最低，显著低于对照22%；除杀菌剂+高温闷地处理，高温闷地和淹水1个月、淹水2个月、淹水3个月处理多酚氧化酶活性均低于对照，分别降低了8.79%、8.30%、13.93%、12.40%。

2.1.3  土壤养分与土壤酶活相关性分析

相关性分析结果（表2）表明，土壤多酚氧化酶活性与速效氮含量有显著的正相关（P<0.05）；土壤过氧化氢酶、脲酶、中性磷酸酶活性与有机质含量等养分均无显著相关性。

2.2  不同改良措施对土壤微生物多样性及群落结构的影响

2.2.1  土壤微生物多样性土壤微生物丰富度和多样性的评价结果（表3）表明，在真菌群落中轮作水稻种的数量显著高于其他处理，其次是对照、 高温闷地、杀菌剂+高温闷地，这3个处理显著高于淹水3个月、淹水1个月和淹水2个月。香农指数和Chao1指数轮作水稻高于其他处理，与处理2、处理3、处理4差异不显著，而显著高于处理5、处理6、处理7。然而在细菌群落中种的数量、香农指数及Chao1指数各处理间差异不显著。

2.2.2  土壤微生物群落结构

不同处理土壤的真菌群落在门水平的丰度排序（前10名）结果（图2）表明，在土壤真菌群落中注释到3个主要的门，球囊菌门（Mortierellomycota）在淹水3个月、淹水2个月、淹水1个月中均是最丰富的门，相对丰度在46.1%～47.4%之间；子囊菌门（Ascomycota）是高温闷地及对照样品中最丰富的门，相对丰度分别为33.5%和36.4%；而在轮作水稻和杀菌剂+高温闷地样品中其他真菌门相对丰度最大，分别为31.1%和29.5%，其次是子囊菌门（Ascomycota），分别为29.8%和28.6%；担子菌门（Basidiomycota）为第3个被注释到的主要门类，各处理相对丰度在 2.9%～ 19.5%之间。

不同处理土壤的细菌群落在门水平的丰度排序（前10名）结果（图3）表明，其中变形菌门（Proteobacteria）丰度大小顺序为淹水1个月＞ 对照＞高温闷地＞淹水2个月＞杀菌剂+高温闷地＞淹水3个月＞轮作水稻处理；酸杆菌门（Acidobacteriota）相对丰度大小排序为水稻轮作＞对照＞杀菌剂+高温闷地＞高温闷地＞淹水3个月＞淹水2个月＞淹水1个月处理；拟杆菌门（Bacteroidetes）各处理均高于对照。

2.3  土壤酶活性与土壤微生物丰富度的相关性分析

2.3.1  土壤酶活性与土壤微生物多样性相关性分析

由表4可知，脲酶活性与真菌ACE指数、Chao1指数呈显著正相关，与香农指数呈极显著正相关；多酚氧化酶与细菌Chao1指数呈显著正相关。而过氧化氢酶和中性磷酸酶活性与真菌、细菌多样性也具有一定相关性，但均未达到显著水平。

2.3.2  土壤酶活性与微生物组成的相关性分析

土壤酶活性与微生物优势门类的相关性结果（表5）表明，脲酶活性与真菌的被孢霉门（Mortierellomycota）、细菌的厚壁菌门（Firmicutes）呈负相关，其中与被孢霉门呈显著水平，与厚壁菌门呈极显著水平，而脲酶与细菌的酸杆菌门（Acidobacteria）呈极显著正相关。过氧化氢酶与细菌的厚壁菌门呈显著负相关。中性磷酸酶和多酚氧化酶与真菌、细菌优势门类具有一定相关性，但均未达到显著水平。

3  讨论与结论

土壤养分含量是衡量土壤肥力的重要指标。吴艾轩等通过分析总结出适合栽种人参土壤的养分条件为含有机质16～30 g/kg、有效氮10～150 mg/kg、速效磷20～50 mg/kg、速效钾200～300 mg/kg^[12]。多项研究证实，多年连续种植土壤养分失衡，且土壤理化性质发生改变，土壤微生物群落多样性降低^[13]。本研究结果发现，不同改良方式对老参地土壤酸碱度无明显作用，处理间差异不大；然而，不同改良措施改变了土壤养分，与老参地（对照）相比，轮作、闷地及淹水处理绝大部分降低了土壤养分含量，这一结果同王克磊等关于番茄与水稻轮作的结果^[14]相同，分析原因为各处理均为浇透水或淹水处理，可有效调节土壤EC值，影响氮磷钾养分的积累量和元素有效性，改善土壤养分状况的效果。进一步分析发现，与对照相比，通过轮作水稻、杀菌剂+高温闷地、淹水1个月处理，可降低土壤有机质和速效氮含量，在一定程度上缓解了土壤盐渍化及养分失衡，改良后土壤中有机质和速效氮含量介于人参生長的适宜范围；然而轮作水稻、杀菌剂高温闷地改良后的土壤速效磷、速效钾含量仍未达到适宜人参生长的标准，仍需进一步优化改进，以创造出适宜人参生长的土壤环境^[2]。

土壤酶在土壤中发挥着至关重要的作用，它的活性大小决定了能量转化的强度，进而影响着土壤质量及植物的生长情况，是判断土壤生化过程强度和评价土壤肥力的重要依据^[15-16]。张泽锦等的研究表明，与旱地连作相比，水旱轮作提高了土壤中3种酶活性，分别为蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性^[17]。周勃等研究发现，以棉花连作地为对照，通过轮作水田处理土壤脲酶活性大幅降低，而土壤磷酸酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性有效增加，土壤质量得到大幅度改善^[18]。刘永亮等研究认为，水旱轮作、淹水处理均提高了土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和蛋白酶活性^[19]。本试验选取过氧化氢酶、脲酶、中性磷酸酶和多酚氧化酶4种重要土壤酶，用于评价土壤修复效果。通过研究得到了相似的结果，与对照相比，除淹水3个月外，其他改良方法均增强了土壤中过氧化氢酶活性，其中轮作水稻处理的过氧化氢酶活性最高，该酶与H₂O₂清除系统密切相关，能有效防止过氧化氢对连作植物的毒害，是土壤微生物代谢的重要酶类，是评价土壤微生境优劣的重要标志；同样，水稻轮作、杀菌剂高温闷地、高温闷地、淹水1个月提高了土壤中性磷酸酶活性，以水稻轮作处理下活性最高，土壤磷酸酶与土壤有机磷分解与转化及生物有效性密切相关，是催化土壤有机磷矿化的酶类，是评估土壤磷素生物转化与强弱的关键指标；同时与对照相比，轮作水稻提高了土壤脲酶活性，土壤脲酶能将有机物分解成氨和二氧化碳，其活性在一定程度上反映了土壤的供氮能力^[20-21]。土壤多酚氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌，醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成有机质和色素，完成土壤芳香族化合物循环，是土壤修复的重要参考指标，然而，除杀菌剂高温闷地外，其余处理土壤多酚氧化酶均低于对照，分析原因可能是土壤多酚氧化酶同其他土壤酶有着共同的底物，在分解底物过程中存在拮抗竞争，抑制了多酚氧化酶活性^[21]。尽管如此，由于影响土壤酶活性的因子较多，在不同研究中所得结论也不尽相同，需要进一步全面综合考虑土壤pH值、有机质、速效氮、有效磷、有效钾含量等土壤理化性质对酶活性的影响。

在一定程度上，土壤理化特性和土壤微生境影响着微生物丰度和群落组成结构，致使微生物多样性表现出非常大的不同。Breidenbach等发现蓄水水稻地和干旱玉米地的土壤微生物群落呈现显著性差异，验证了差异的地块生境条件决定了土壤微生物群落结构和组成^[22]。本研究发现，与对照相比，轮作水稻提高了土壤真菌多样性和丰度，降低了土壤细菌多样性及丰度；而杀菌剂高温闷地、高温闷地及淹水处理对土壤微生物的影响则呈现相反的作用，分析原因可能为轮作水稻处理的土壤生境与其他处理存在差异所致，进一步分析认为可能是由于真菌和细菌对淹水种植水稻的响应不同，在作物水稻的影响下，土壤微生物结构发生改变，产生更适宜水稻生长的微生物结构组成。而不同改良措施下优势菌门大致相似，其中真菌微生物为子囊菌门、球囊菌门、担子菌门；细菌微生物为变形菌门、酸杆菌门等。进一步分析土壤微生物优势门类与土壤酶活的相关性显示，两者间的相关性却存在较大差异，表现在不同处理中不同酶活性可与不同门类菌存在极显著、显著或一般性的正向或反向相关，不一定是相同的趋势。由于人参、根际土与微生物间的关系极其繁杂，既密不可分，又相互影响，不同改良措施对土壤微生物种类、数量和组成结构等多样性的影响不尽相同，同时又受土壤理化性状及酶活性的影响。

综上所述，不同改良措施均對老参地土壤养分、土壤酶活、土壤微生物结构丰度产生不同程度的影响。与对照相比，水旱轮作降低了土壤中速效氮、速效磷、速效钾及有机质含量，有效缓解了土壤盐渍化；土壤中中性磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶活性显著提升。土壤微生物分析结果亦显示，土壤真菌丰度显著提高，细菌丰富降低，土壤微生物总体呈现丰度和多样性提高。综合以上研究结果，认为水旱轮作可减轻老参地常年集约化种植而产生的土壤恶化问题，改善人参连作障碍。同时，结合土地生产经济效益，种植水稻是比较理想的改良模式，因此研究认为水旱轮作有望在平整老参地上得到应用，通过改善土壤基础结构、提升酶活性和丰富土壤微生物多样性来发挥积极有效的缓解连作障碍作用，为土壤改良及土地高效利用奠定理论基础。

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