不同梨品种花粉量与活力差异的研究

葛彤 齐开杰 谢智华 岳冬 王亚茹 王鹏 毛海艳 张岩 张绍铃 吴巨友

摘要：以105个梨品种为试验材料，调查单花花药量和单花药花粉量，对散粉效果较好的77个品种进行花粉活力检测。结果表明，不同梨品种花粉量及花粉活力存在差异，花粉数量性状变异系数大，花粉变异程度高。其中，单花花药量变幅为13～36粒，单花药花粉量变幅为0～15 440粒，除花粉萌发率为0%的品种外，其余品种花粉萌发率变幅为1.76%～82.74%，花粉管长度变幅为102.49～400.29 μm。经系统聚类分析，供试品种被分为六大类群，其中第Ⅰ、第Ⅱ类群的15个品种花粉量多、花粉萌发率高且花粉管生长速率较快。经正态性检验发现，单花花药量、单花药花粉量和花粉萌发率符合正态分布规律，将符合正态分布的花粉数量性状用4个分点分为5级，明确了每级花粉数量性状的频率分布。初步筛选出15个花粉育性较好的品种以及9个花粉败育品种，为梨园授粉树配置和种质创新提供参考。

关键词：梨；花药量；花粉量；花粉活力；聚类分析；花粉败育

中图分类号：S661.203  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）06-0142-08

收稿日期：2023-05-24

基金项目：国家重点研发计划（编号：2022YFD1200503）；国家现代农业产业体系建设专项（编号：CARS-28）。

作者简介：葛彤（1998—），女，江苏徐州人，硕士研究生，从事梨园花果管理研究。E-mail：1413230543@qq.com。

通信作者：吴巨友，博士，教授，博士生导师，从事梨种质资源创新、成花受精机理与产业应用研究。E-mail：juyouwu@njau.edu.cn。

梨是蔷薇科（Rosaceae）梨属（Pyrus）植物，我国是梨的起源中心，栽培历史悠久、种植范围广泛，具有丰富的梨种质资源^[1]。花粉是研究植物遗传、育种、生殖和进化的重要材料，明确不同品种的花粉育性和授粉特性是开展高效栽培和良种繁育工作的基础^[2-3]。梨作为典型的配子体自交不亲和果树，多数品种自花授粉不能结实，为保证果园丰产稳产，花期通常采用配置授粉树或人工辅助授粉等方法来提高花粉授粉效果^[4]。不同梨品种之间亲缘关系复杂，花粉育性和交配亲和性差异显著，部分品种存在雄性不育现象^[5-6]。有研究显示，梨的花粉萌发率和花粉量呈现出越靠近梨属植物起源地越高的趋势^[7]。因此，探究不同梨品种花粉量和花粉育性，对充分利用梨特异种质、合理配置授粉树以及杂交育种具有重要研究意义。目前，关于梨花粉量和花粉萌发率差异的研究已有较多报道，但主要集中在花粉萌发水平和授粉特性上，而有关花粉育性分类和数量性状分级的报道较少^[8-10]。

因此，本研究通过调查不同梨品种的花粉量与花粉活力，对其花粉数量性状进行概率分级，同时结合系统聚类分析，明确各品种花粉育性，筛选出花粉败育品种，以期为生产实践中授粉品种的选用和种质创新提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料及取样

试验于2022年2月底至4月初进行，105个梨品种的花蕾材料采自南京农业大学梨种质资源圃和江苏省睢宁县示范基地。每个品种随机采集处于大蕾期的铃铛状大花蕾约100朵，剥下花药，取50粒饱满、未开裂的花药用于单个花药花粉量测定，其余花药用硫酸纸包好后置于硅胶中阴干，待花粉全部散出后，加干燥剂，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2  单花花药量与单花药花粉量检测

随机采集各品种处于大蕾期的铃铛状大花蕾约100朵，揉开花蕾，记录不同品种单朵花蕾的花药数量并计算每个品种单花花药量的平均值，统计花药量后及时剥下花药，随机取50粒形状饱满、尚未开裂的花药放入2 mL离心管中^[10]，將离心管放入35 ℃烘箱中干燥，待花粉完全散出后加入2 mL浓度为200 g/L的六偏磷酸钠溶液，在漩涡振荡器上振荡成悬浮液。分别取400 μL悬浮液和1 600 μL六偏磷酸钠溶液置于新的2 mL离心管中，摇匀，吸取5 μL混合后的溶液滴在载玻片上，在Olympus IX 73显微镜下随机选取3个视野拍照，统计单花药花粉量（粒）。

单花药花粉量（花粉量/花药）=每个载玻片上总花粉数×40。

1.3  花粉萌发率与花粉管长度检测

将花粉从-20 ℃冰箱中取出，在4 ℃条件下放置2 h，再移至室温下放置2 h，使花粉逐渐解冻。刮取适量花粉置于2 mL离心管中，加入400 μL液体培养基[其配方为10%蔗糖+0.01%硼酸+0.03% Ca（NO₃）₂·H₂O+30 mmol/L 2-吗啉乙磺酸（MES），pH值为6.2]，混匀后放入25 ℃、120 r/min的摇床中培养3 h，统计花粉萌发率和花粉管长度。每个处理观察3个视野，以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发，随机选取50根花粉管拍照，并使用Image J软件测量花粉管长度。

花粉萌发率=已萌发花粉数/花粉总数×100%。

1.4  花药横切面石蜡切片观察

将适量花药放入50%甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液中固定后，送至武汉赛维尔生物科技有限公司制作石蜡切片。将切片放置在倒置显微镜下观察药室内花粉数量。

1.5   数据分析

数据采用Excel和IBM SPSS Statistics 24软件进行分析，分别统计平均值、标准差等。利用Kolmogorov-Smirnov检验法对花粉数量性状进行正态分布检验。将符合正态分布的数量性状划分为5个等级，4个分点依次为x-1.281 8s、x-0.524 6s、x+0.524 6s和x+1.281 8s，1～5级分布的概率依次为10%、20%、40%、20%、10%，其中：x为各性状的平均值，s为各性状的标准差^[11]。利用GraphPad Prism 8.0.2软件对单花药花粉量、花粉萌发率及花粉管长度进行变异系数统计与相关性分析。

2  结果与分析

2.1  不同梨品种花粉量及花粉活力调查

调查结果（表1）显示，单花花药量变幅为13～36粒，平均花药量为23粒；单花药花粉量变幅为 0～15 440 粒，大多品种单花药花粉量分布在907～8 627粒范围内，占供试品种总数的72.38%。其中，龙香、绿安久和六棱梨花粉量极少，夏露、夏清和黄金梨等11个品种没有检测到花粉。

花粉萌发率和花粉管生长速率可反映花粉活力，本试验中花粉管长度为花粉培养3 h后的生长量，可用花粉管长度反映花粉管的生长速率。对77个散粉效果好的梨品种进行花粉萌发率和花粉管长度检测，结果表明，除建始早古、水洞瓜和海棠酥这3个品种的花粉萌发率为0外，其余品种花粉萌发率变幅为1.76%～82.74%，花粉管长度变幅为102.49～400.29 μm。其中，28个供试品种花粉萌发率在50%以上，占供试品种总数的36.36%。

2.2  花药横切面观察

在花粉量检测过程中发现，有14个品种花粉量极少或无花粉，为验证调查结果，对其花药横切面进行切片观察（图1）。梨花药由4个花粉囊和药隔组成，正常成熟花药横切面一般呈蝶形，花粉均匀布满药室。以花粉量较多的阳信大鸭梨为对照（CK），其药室内均匀布满花粉粒；而夏露（图1-A）、黄金（图1-B）、新高芽变（图1-C）、八里香（图1-D）、云南黄酸梨（图1-G）、宁霞（图1-H）、夏清（图1-I）、天皇（图1-J）和新梨7号（图2-K）这9个品种的药室内无花粉，花药呈空囊状，石蜡切片与花粉量检测结果基本一致，判断为花粉败育品种。绵梨（图1-E）和酒泉长把（图1-F）花药较小，呈皱缩状态，发育不完全；绿安久（图1-L）花药皱缩未开裂；龙香（图1-M）和六棱梨（图1-N）花药开裂，但药室内花粉含量少，花粉量异常机理有待进一步研究。

2.3  花粉量、花粉萌发率及花粉管生长速率聚类分析

以花粉量、花粉萌发率及花粉管长度为变量，对花粉可萌发的品种进行系统聚类分析，74个梨品种被分为6个类群（表2）。第Ⅰ类群包括花粉量大、萌发率高且花粉管生长速率快的3个品种，分别为连城石头梨、龙都大鸭梨和大洋木梨（莆田），其平均花粉量为14 107粒，平均萌发率为54.58%，平均花粉管长度255.20 μm。第Ⅱ类群包括12个品种，其花粉量较大，花粉萌发率较高，花粉管生长速率较快。第Ⅲ类群包括15个品种，为花粉量较高，花粉萌发率和花粉管长度处于中等水平的品种。第Ⅳ类群包括18个花粉量和花粉萌发率中等，但花粉管长度较短的品种。第Ⅴ类群包括10个品种，为花粉量较少、花粉萌发率较低，但花粉管生长速率较快的品种。第Ⅵ类群包括16个品种，其花粉量、萌发率和花粉管生长速率均表现较差。综合比较之下，第Ⅰ、第Ⅱ类群品种的花粉育性最好，第Ⅲ、第Ⅵ类群品种的花粉育性中等，第Ⅴ、第Ⅳ类群品种的花粉育性最差。

2.4  花粉数量性状的正态性检验及频率分布

经Kolmogorov-Smirnov检验，除花粉管长度的P值为0.023，不符合正态分布规律外，单花花药量、单花药花粉量及花粉萌发率的P值均大于0.1，符合正态分布规律。将符合正态分布规律的3个数量性状依据分级标准（表3）划分为5个等级，4个分点依次为x-1.281 8s、x-0.524 6s、x+0.524 6s和x+1.281 8s，其分布频次如图2所示。根据分点值确定取值范围并计算分布频率，通过变异系数将数据多样性进行量化。

单花花药量的变幅为13～36粒，平均单花花药量为23粒，变异系数为16.81%。单花花药量概率分级的频率分布：1级（＜18粒）占4.8%，2级（18～21粒）占20.0%，3级（>21～25粒）占41.9%，4级（>25～28粒）占19.0%，5级（>28粒）占14.3%。

单花药花粉量的变幅为0～15 440粒，平均花粉量为5 411粒，变异系数为64.58%。单花药花粉量概率分级的频率分布：1级（＜932粒）占14.29%，2级（932～3 578粒）占19.05%，3级（>3 578～7 244粒）占36.19%，4级（>7 244～9 890粒）占20%，5级（>9 890粒）占10.48%。

花粉萌发率的变幅为0～82.74%，平均花粉萌发率为39.69%，变异系数为57.58%。花粉萌发率概率分级的频率分布：1级（＜10.40%）占10.38%，2级（10.40%～27.70%）占24.68%，3级（>27.70%～51.68%）占31.29%，4级（>51.68%～68.98%）占18.18%，5级（>68.98%）占15.58%。

2.5  花粉性状相关性分析

结合皮尔逊相关系数及散点图对单花药花粉量、花粉萌发率及花粉管长度进行相关性分析。结果（图3）表明，单花药花粉量与花粉萌发率、花粉管长度之间均呈弱相关性，相关系数分别为0.360和0.252；花粉萌发率与花粉管长度之间呈显著正相关，皮尔逊相关系数为0.662。

3  討论

3.1  不同梨品种花粉量及花粉活力的差异

花粉质量是保证授粉效果的关键，直接影响果实的产量和品质，花粉量主要取决于品种本身的遗传特性、树体营养水平及生存环境^[12]。在对枣、桃、葡萄和苹果等果树的花粉研究中发现，不同果树或同一果树的不同品种间花粉量及花粉活力存在差异^[13-17]。在本研究中，不同梨品种花粉量、花粉萌发率及花粉管生长速率差异明显，与其他果树花粉研究结果类似。花粉活力不仅与花粉自身遗传特性有关，而且受外界环境如温度、相对湿度、贮藏介质、辐射、光照、空气质量等多重因素影响^[18-19]。因此，在本研究中导致建始早谷、水洞瓜和海棠酥花粉萌发率为0的因素较多，花粉未萌发的具体原因有待进一步探究。通过对梨花粉数量性状特征进行概率分级，明确每级花粉数量性状的频率分布，更加客观统一地描述、评价梨花粉性状，也证实花粉数量性状具有变异系数大、变异程度高、多样性丰富的特点^[11]。单花花药量、单花药花粉量和花粉萌发率符合正态分布规律，而花粉管长度不符合正态分布规律，与李芳芳等研究中“花粉量与花粉萌发率均不符合正态分布规律”的结论^[10]有所不同。

3.2  花粉量大且活力强的品种筛选

多数梨品种自花不结实或自花结实率低、低温阴雨天气和品种花期不遇等问题均可影响花粉正常发育，需配置授粉树或人工辅助授粉，以保证丰产稳产^[4]。依据花粉特性对品种进行分类的结果，可为杂交亲本的选择和授粉树的配置提供参考。本研究通过聚类分析，将供试梨品种划分为育性不同的六大类群，筛选出白梨系统中的夏半伏梨、阳信大鸭梨、龙都大鸭梨、泊头大鸭梨、新鸭梨、金坠、金花1号、汉源白梨，砂梨系统中的金水酥、苍溪六月雪、大洋木梨（莆田）、玉冠，秋子梨系统中的辽阳大香水以及地方品种长泰台湾梨、连城石头梨等15个花粉量大、花粉萌发率高且花粉管生长速率快的品种。花粉质量是保证授粉效果的关键，选择花粉量大、花粉活力强的品种用于授粉，能够有效解决生产中授粉不良、产量不高等问题。由于多数梨品种自花授粉不结实，品种间是否亲和、花期是否相近成为梨园配置授粉树时必须考虑的因素，另外，种间远缘关系也会造成无法相互授粉或受精率很低。因此，授粉前应进行S基因型比较，依据亲缘关系，选择与主栽品种亲和并且花期相近的品种作为授粉树，以保证较好的授粉质量。

3.3  雄性不育品种的验证

植物雄性不育现象主要表现为雄蕊发育异常、不能产生有正常功能的花粉，但雌蕊可正常发育并能接受花粉而受精结实^[20]。雄性不育现象广泛存在于自然界开花植物中，桃、杏、葡萄、柑橘等许多果树具有不育品种^[21-24]。部分梨品种也存在雄性不育现象，并推断为细胞质雄性不育，主要是由绒毡层发育异常或多重因素共同影响而导致花粉败育，且败育时期集中在单核小孢子晚期。先前有报道指出，黄金、八里香、夏露、夏清、天皇和新梨7号花粉败育^[5，25-27]，与本研究结果一致。此外，本研究还发现，新高芽变、云南黄酸梨和宁霞存在花粉败育现象，而绵梨、酒泉长把、绿安久、龙香和六棱梨花粉量极少或无花粉，花粉是否败育还有待验证。绵梨、酒泉长把和绿安久可能由于花器官发育不完全、花药较小才未检测出花粉；通过花药横截面显微观察，发现龙香和六棱梨的花药已经开裂，但散粉少，导致无法进一步检测其花粉萌发率。因此，这些品种不能完全确定是否花粉败育。雄性不育品种是种质创新的重要材料，在育种过程中可有效简化育种程序、提高育种效率，具有较高的利用价值。目前，关于梨树雄性不育的报道主要集中在细胞学和生理机制层面，在分子生物学方面研究较少，未来应深入探究梨樹雄性不育机制，为合理利用梨种质资源提供参考。

4  结论

本研究结果表明，不同梨品种花粉量与花粉活力差异明显，花粉数量性状变异系数大，花粉变异程度高，具有丰富的遗传多样性。筛选出连城石头梨、龙都大鸭梨和大洋木梨（莆田）等15个单花药花粉量大且花粉活力较好的品种，以及新高芽变和云南黄酸梨等9个存在花粉败育现象的品种，为梨园授粉树配置和种质创新提供参考。

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