烟草碳代谢产物及关键酶基因对移栽期的响应

钱雪松 黄人杰 周俊成 彭三喜 郜军艺 熊晶 高焕晔

摘要：探究威宁黑石地区移栽期对云烟87大田期碳代谢产物含量、碳代谢酶活性及其关键基因表达量的影响，为明确威宁黑石地区最适宜的移栽时期，提高烟叶品质提供理论依据。以云烟87为试验材料，采用随机区组试验设计，移栽期设4个水平：T1（4月10日）、T2（4月20日）、T3（4月30日）、T4（5月10日），2022年于毕节市威宁地区开展田间试验，在大田不同生育时期测定云烟87碳代谢产物及关键酶基因对移栽期的响应。结果表明，云烟87旺长期、现蕾期烟叶中还原糖含量呈先升后降的趋势，且随生育进程推进，各移栽期处理的还原糖含量也呈先升后降的趋势，T2处理烟叶还原糖含量在多数生育期处于较高水平；各移栽期处理的总糖含量的变化规律在各生育期都不尽相同，T2处理烟叶总糖含量在多数生育期处于较高水平；淀粉含量则随移栽期推迟，在生育前期呈先降后升的趋势，在生育后期呈先降后升再下降的趋势。碳代谢酶活性方面，移栽后30～70 d，α-淀粉酶（α-Amylase）活性最低的处理均为T3或T4处理，T2处理活性均为最高或第二高；在同一生育时期内，蔗糖合成酶（SS）、蔗糖转化酶（INV）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性最高的多数为T3、T4处理。碳代谢关键酶基因表达量方面，α-淀粉酶基因（Ntα-Amylase）、蔗糖酶合成酶基因（NtSS）表达量总体以较早移栽处理（4月10日、4月20日）较高。相关性结果分析表明，碳代谢产物含量、碳代谢酶活性及其关键酶基因表达量之间在不同生育时期均有不同程度的联系。综上，威宁黑石地区4月20日移栽，有利于碳代谢活动的进行。

关键词：烟草；移栽期；碳代谢产物；关键酶；基因；表达量

中图分类号：S572.01；S572.04  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）06-0117-08

收稿日期：2023-07-22

基金项目：贵州省烟草公司毕节市公司项目（编号：2022520500240190）。

作者简介：钱雪松（1997—），男，贵州遵义人，硕士研究生，主要从事烟草栽培生理生化研究。E-mail：2503844123@qq.com。

通信作者：高焕晔，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事烟草栽培生理生化研究。E-mail：294248298@qq.com。

烟草（Nicotiana tabacum L.）是茄科烟草属一年生草本植物，作为我国重要的经济作物，对促进我国经济发展具有重要意义。烟叶的品质和产量直接影响烟草行业发展和烟草种植户收益，烟叶品质是多因素（遗传因素、生态环境和栽培技术）协同作用的结果，其中栽培技术是影响烟叶优质高产的关键因素之一^[1-3]。栽培技术能保证且调控烤烟碳代谢过程，从而影响烤烟碳代谢产物的积累及风味的形成^[4]。移栽期是通过调整烟株的大田生长期所处的气候条件，进而影响烤烟生长发育、产量和品质^[5-8]。因此，选择适宜的移栽期，可充分利用气候资源，最大限度地促进优质烟叶形成，对烤烟品质改良具有重要意义^[9]。

陈义强等的研究表明，移栽期过于提前，烟株在大田前期将遭遇低温，易导致提早开花，碳代谢活动受到抑制，最终导致产量和品质降低^[10]。若移栽期过于推迟，烟株苗期环境温度较高，烟苗生长加快，不利于碳代谢产物积累，烟叶不能正常成熟，烤烟品质显著降低^[11]。相关研究表明，烤烟碳氮代谢强度、协调性及其动态变化均影响着烟叶化学成分含量和协调性、香吃味（感官评价中的香气特性、口感特性）等^[12]。碳代谢过程中，各种酶活性的变化对碳代谢产物含量起重要调节作用^[13]。潘飞龙等研究发现，蔗糖合成酶、蔗糖转化酶、蔗糖磷酸合成酶活性对蔗糖积累均有不同程度的影响，相关酶活性及基因表达量的差异可能是造成碳代谢产物差异的重要原因^[14-15]。随着移栽期的后移，烟株的大田生育期相对推迟，整个生育期相应缩短，碳代谢强度受到影响，从而对烤烟总糖、还原糖、淀粉等碳代谢产物有不同程度的影响^[16-23]。目前，相关研究对象大多是以低海拔為生态背景的烟区，对威宁黑石这种地处乌蒙山脉中部，属亚热带季风湿润气候的高海拔烟区研究较少，同时还缺乏大田期碳代谢产物与碳代谢关键酶活性及其基因表达量的相关性研究。

本研究以云烟87为材料，通过测定威宁黑石地区不同移栽期处理下云烟87大田碳代谢产物含量、关键酶活性及关键基因表达量，明确该地区最适宜的移栽时期，为威宁黑石优质烟叶生产提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验地概况

试验于2022年在贵州省威宁县黑石头镇河坝村烟草科技园（26.754 725°N，103.995 142°E）进行，海拔2 218 m，年均气温10.9 ℃，年总积温 3 996 ℃，年降水量981 mm，年无霜期182 d；试验地块地势平坦，肥力均匀，排水优良，上一个种烟季节未发生青枯病、黑胫病等病害，距离公路300 m以上。试验地土壤为黄壤土，土壤pH值为5.88，耕层土壤有机质含量11.32 g/kg，碱解氮、速效磷、速效钾的含量分别为89.43、11.08、241.37 mg/kg。以绿肥为前作。

1.2  试验材料

供试品种为云烟87。

1.3  方法

1.3.1  试验设计

不同移栽期处理设置4个水平：T1（4月10日移栽）、T2（4月20日移栽）、T3（4月30日移栽）、T4（5月10日移栽）。田间试验采取随机区组试验设计，3次重复，每个小区种植4行（行距1.1 m，株距0.5 m），每行25株，试验地四周设置保护行。烟苗采用分期播种，以保证不同移栽期所用烟苗苗龄一致。其他栽培管理技术按所在基地单元生产技术方案执行（基肥45 kg/hm₂，N∶P∶K=9∶13∶24；提苗肥3 kg/hm²，N∶P∶K=15∶8∶7；追肥23 kg/hm²，N∶P∶K=13∶0∶26）。

1.3.2  测定项目

1.3.2.1  鲜烟叶碳代谢主要产物大田期鲜烟叶碳代谢主要产物测定：各处理于团棵期、旺长期、现蕾期、成熟采烤期选择代表性烟株3株，取样后洗净擦干，分上部叶、中部叶、下部叶（相对部位），置于烘箱中105 ℃杀青30 min，再在65 ℃下烘干至恒重。采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定烟叶总糖、还原糖、淀粉的含量。

1.3.2.2  碳代谢关键酶活性各处理在烟株分别移栽后30、40、50、60、70 d进行取样，每个处理选择长势一致的烟株，采集烟株中部叶片（相对位置为烟株中部），相同叶位每株仅取1次，选取9个单株为一次样品采集，每3株混合为1个样本，3次生物学重复，将上述烟叶分别沿主脉分为2份，迅速置于干冰中冻存，一份用于碳代谢相关酶活性的测定。采用ELISA检测试剂盒测定碳代谢相关酶[α-淀粉酶（α-amylase）、蔗糖合成酶（SS）、蔗糖转化酶（INV）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）]的活性。

1.3.2.3  碳代谢关键酶基因表达量另一份烟叶用于碳代谢关键基因酶表达的测定。利用实时荧光定量PCR（qRT PCR）技术检测碳代谢关键基因[α-淀粉酶基因（Ntα-amylase）、蔗糖合成酶基因（NtSS）]的相对表达量。引物如表1所示，PCR反应体系和程序按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，Q711）试剂盒进行。

1.4  气象条件检测

2022年4—9月试验地点气象数据结果（图1）表明，旬均气温在7.1～19.6 ℃之间，呈波浪线形变化；4月下旬、5月中下旬、6月上旬及7月上旬降水量比较充沛； 4月下旬日照时数最长。地下5 cm及地下15 cm土壤温度均在22.1 ℃左右波动。不同土壤层湿度变化趋势总体一致。7月上旬至9月中旬，地下5、15 cm土壤层湿均呈凹峰变化，且各土壤层间湿度差异不大。

1.5  数据统计与分析

数据采用Excel 2016进行统计处理和制表，Origin 2021进行制图，利用SPSS 26数据统计软件进行方差分析、相关性分析；处理间差异显著性比较采用邓肯氏法（α＝0.05、α＝0.01），处理间相关性分析采用Pearson法，显著性水平为α=0.05，极显著性水平为α=0.01。

2  结果与分析

2.1  移栽期对云烟87大田期碳代谢产物的影响

2.1.1  移栽期对下部叶碳代谢产物的影响

为明晰移栽期对烟苗下部叶碳代谢产物的影响，在团棵期、旺长期、现蕾期和成熟期进行下部叶取样，测定烟叶还原糖、总糖和淀粉的含量（图2）。随着移栽期推迟，烟苗团棵期、现蕾期下部叶中还原糖含量下降，T1和T2处理的还原糖含量显著高于T3和T4处理（P<0.05）；成熟期烟苗下部叶还原糖含量以T2处理最佳，显著高于其他移栽期，含量达到（10.11±1.01）%；烟苗生育进程（现蕾期除外）中下部叶还原糖含量各移栽期均表现为先增加后减少。烟苗旺长期T1处理和团棵期T2处理下部叶总糖含量显著高于其他3个处理。T4处理烟苗生育前期（团棵期、旺长期）下部叶淀粉含量显著高于其他移栽期处理；尽管T1和T2处理烟苗发育前期（团棵期、旺长期、现蕾期）下部叶淀粉含量较低，但在成熟期时，T1和T2处理显著高于T3和T4处理。

2.1.2  移栽期对中部叶碳代谢产物的影响

为明晰移栽期对烟苗中部叶碳代谢产物的影响，在团棵期、旺长期、现蕾期和成熟期进行中部叶取样，测定烟叶还原糖、总糖和淀粉的含量（图3）。不同移栽期处理对烟苗生育前期（团棵期、旺长期）中部叶还原糖含量影响不大，对烟苗生育后期存在显著影响。现蕾期时，T1处理烟苗中部叶还原糖含量达到（9.27±0.43）%，T2处理达到（9.76±1.22）%，T3处理达到（10.15±1.01）%，均显著高于T4处理（6.25±1.23）%，而成熟期T3、T4处理显著高于T1、T2处理；不同移栽期处理烟苗中部叶还原糖含量存在共性，即旺长期和现蕾期快速积累，成熟期时含量降低。只有T1处理烟苗旺长期中部叶总糖含量显著高于其他3个处理，与上部叶的T1处理结果（图4）相似。不同移栽期烟苗中部叶淀粉主要在成熟期积累，其中T2处理的淀粉含量最高，为（27.12±0.90）%，显著高于其他处理，T3处理最低，为（15.10±0.91）%。

2.1.3  移栽期对上部叶碳代谢产物的影响

为明晰移栽期对烟苗上部叶碳代谢产物的影响，在团棵期、旺长期、现蕾期和成熟期进行上部叶取样，测定烟叶还原糖、总糖和淀粉的含量（图4）。烟草生育前期（团棵期、旺长期）上部叶还原糖含量以T2处理最高，后期各移栽期处理间无顯著差异。不同移栽期处理烟苗上部叶总糖含量在团棵期表现出较大差异，T2处理最高，为（34.62±1.62）%，T3处理次之，为（21.54±1.93）%，T1、T4处理的含量较低，分别为（17.80±0.54）%、（15.78±0.14）%；T1处理烟苗旺长期总糖含量高于其他处理。淀粉含量在不同生育时期无明显变化规律。

2.2  现蕾期与成熟采烤期碳代谢产物相关性分析

现蕾期碳代谢产物与成熟采烤期碳代谢产物相关性分析结果见表2，烤烟现蕾期总糖含量与成熟采烤期淀粉含量呈极显著正相关关系（P<0.01），现蕾期淀粉含量与成熟采烤期淀粉含量呈显著负相关关系（r=-0.359）。结果表明，烤烟现蕾期总糖含量、淀粉含量的变化对成熟期烟叶淀粉积累影响较为明显。

2.3  移栽期对碳代谢关键酶活性的影响

为明晰移栽期对烟苗碳代谢酶活性的影响，在烟苗移栽后30、40、50、60、70 d取样，测定α-淀粉酶、蔗糖合成酶、蔗糖转化酶、蔗糖磷酸合成酶的活性，结果见图5。α-amylase活性以T1处理的烟株活性较高，移栽后30、60、70 d烟株的α-amylase活性显著高于其他移栽期处理，T2处理烟株在移栽 40 d 后α-amylase活性最高。T3处理烟株在移栽后30、40、50 d的SS活性最高，分别为1052.32、818.05、1 036.12 U/g；T4处理烟株则在移栽60 d后SS活性达到888.22 U/g，移栽70 d后达到1 093.34 U/g。随着移栽期的推迟，烟株的INV活性总体呈增加趋势，而在移栽后40 d其活性则呈降低趋势；在移栽后50、60、70 d，INV活性总体较高的是T4处理烟株，分别为327.24、321.84、297.68 U/g，T3处理的INV活性在移栽后50、60 d最高；且各移栽期处理中INV活性总体均在移栽后40～60 d达到最高，INV活性在进入旺长期（移栽后30 d）后总体以较晚移栽的T4处理烟株较高。SPS活性在移栽后40 d以较晚移栽烟株表现较好，在移栽后30 d是T3处理烟株表现最好，为 88.12 U/g，移栽后40 d是T4处理烟株表现最好，为86.91 U/g；移栽后50～60 d SPS活性表现最好的是T1处理烟株，分别为94.26、71.29 U/g，移栽后30～70 d总体表现较差的是T2处理烟株。

2.4  移栽期对碳代谢关键酶基因表达量的影响

Ntα-amylase和NtSS这2个基因是烟草碳代谢途径中的关键基因，其表达量可以在一定程度上反映植株碳代谢强度。通过检测不同移栽期烤烟生长至30、40、50、60、70 d的碳代谢关键酶基因表达，进一步明晰移栽期对云烟87烟叶碳代谢的影响。qRT PCR结果如表3所示，T1处理烟苗Ntα-amylase和NtSS基因表达量均处于较高水平，T2处理移栽后30 d表达量显著高于其他处理。

2.5  大田期碳代谢产物与碳代谢关键酶活性的相关性分析

对大田期碳代谢产物与碳代谢关键酶活性进行相关性分析，结果见表4。在团棵期，α-amylase活性与总糖含量、INV活性与淀粉含量均呈极显著正相关关系（P<0.01），相关性系数均在0.700以上；SS活性与还原糖含量显著负相关，与淀粉含量呈极显著负相关关系。在旺长期，SPS活性与总糖含量呈极显著正相关关系，r=0.850；SPS活性与淀粉含量呈显著正相关关系，r=0.641；INV活性与总糖含量呈极显著负相关关系，相关系数r=-0.773。现蕾后，α-amylase活性与淀粉含量、SS活性与还原糖含量、SPS活性与还原糖和总糖含量、INV活性与总糖含量均为显著负相关关系。

2.6  大田期碳代谢产物与碳代谢关键酶基因表达量的相关性分析

对大田期碳代谢产物与碳代谢关酶基因表达量进行相关性分析，结果见表5。在团棵期，仅有Ntα-amylase表达量与总糖含量的相关性达到显著水平，相关系数r=0.590，而其他指标的相关性总体为低度相关。

NtSS表达量在旺长期对淀粉含量变化有较大影响，其相关性分析结果达到极显著水平，相关系数r=0.900；在现蕾期，Ntα-amylase表达量与总糖含量呈显著正相关。

2.7  大田期碳代谢关键酶活性及其关键酶基因表达量的相关性分析

對大田期烤烟碳代谢关键酶基因表达量和碳代谢关键酶活性进行相关性分析，结果见表6。烤烟移栽后30 d，Ntα-amylase表达量与α-amylase活性呈显著正相关关系，相关系数r=0.861。移栽后50 d，Ntα-amylase表达量与SPS活性呈显著正相关关系，相关系数r=0.936。移栽后60 d，Ntα-amylase、 NtSS表达量与α-amylase活性之间的正相关性系数均达到0.9以上，达极显著水平，而Ntα-amylase、NtSS表达量与INV活性的负相关系数均在0.8以上，达显著水平。

3  讨论

蒋代兵等研究发现，龙岩烟区烟株2017年1月15日移栽较常规的2017年1月25日移栽更有利于碳代谢产物积累^[24]。曾文龙等的研究表明，龙岩烟区烟株随移栽期推迟，碳代谢产物含量逐渐下降^[25]。余永旭等的研究表明，重庆奉节烟区烟株随移栽期推迟，碳代谢活动逐渐减弱^[26]。这与本研究结果不一致，这是因为福建龙岩烟区属亚热带海洋性季风气候，海拔较低，降雨充沛，日照时数较少，烟株后期碳代谢衰弱，致碳代谢产物减少；重庆奉节烟区属亚热带湿润季风气候，降雨充沛，海拔受地形变化影响。说明烟株碳代谢活动受降雨条件影响较大，降雨过多可能会受抑制。

白应香研究发现，黔西南烟区云87随移栽期推迟，总糖含量增加，还原糖含量降低^[27]。这与本研究有所差异，可能其所设置移栽处理间隔较小所致。卢鹏宇等研究发现，清镇烟区烟株随移栽期推迟，还原糖含量、总糖含量均呈上升趋势^[28]。高真真等的研究表明，河南烟区烟株上6叶总糖含量、还原糖含量随移栽期推迟呈上升趋势^[29]。这与本研究结果一致。

研究显示，通过对相关酶活性的调控可以改变烤烟碳代谢活动的强弱，进而影响碳代谢产物含量^[30]。白应香研究发现，在烤烟大田生长期，不同移栽期处理烟株在移栽40～50 d后α-amylase活性达到峰值，之后下降，说明烟株生长前期对淀粉的积累量较少，随着烟株生育进程的推进，淀粉积累量逐渐增加，进入烟叶成熟期后烟叶淀粉含量又逐渐降低^[27]；本研究中，α-amylase活性总体以较早移栽的处理较高，这与较早移栽处理前期降雨和光照均充足有关。王寒等研究发现，提前移栽处理烟株淀粉酶活性峰值出现推迟，提前移栽处理烟株淀粉酶活性峰值出现的时间提前^[31]；本研究中SS、INV和SPS活性同样总体以较晚移栽的处理较高，且SS的活性在团棵期对还原糖含量有显著影响，SPS、INV活性对烤烟主要碳代谢产物的合成和积累的影响主要集中在旺长期至现蕾期。碳代谢相关基因对烟株碳代谢产物的合成与积累具有重要的调控作用^[32]。潘飞龙研究发现，烤烟适熟至过熟阶段，烟叶NtSS表达量对烟叶糖代谢活动的调控作用较强^[33]。王红丽等研究发现，随着烟叶的成熟度增加，NtSS表达量升高^[34]。白应香研究发现，在黔西南州亚热带季风湿润气候条件下，云烟87移栽后50～60 d，NtSS表达量呈下降趋势^[27]，表达量总体变化趋势与鲁黎明等的研究结论^[35]一致。本研究中，Ntα-Amylase、NtSS基因表达量总体以较早移栽处理（T1、T2处理）较高。碳代谢关键酶基因对碳代谢产物合成和积累的影响主要在烟株进入旺长期以后，其中旺长期NtSS表达量与淀粉含量变化极显著正相关。

4  结论

对于云烟87大田期烟叶的碳代谢产物方面，随着生育进程推进，云烟87旺长期、现蕾期烟叶中还原糖含量呈先升后降的趋势，各移栽期处理的还原糖含量也呈先升后降的趋势，T2处理烟叶还原糖含量在多数生育期处于较高水平；各移栽期处理的总糖含量的变化规律在各生育期都不尽相同，T2处理烟叶总糖含量在多数生育期处于较高水平；淀粉含量则随移栽期推迟，在生育前期呈先降后升的趋势，在生育后期呈先降后升再下降的趋势。碳代谢酶活性方面，移栽后30～70 d，α-amylase活性最低的处理均为T3或T4处理，T2处理活性均为最高或第二高；在同一生育时期内，SS、INV、SPS活性最高的多数为T3、T4处理。碳代谢关键酶基因表达量方面，Ntα-amylase、NtSS表达量总体以较早移栽处理（4月10日、4月20日）较高。相关性结果分析表明，碳代谢产物含量、碳代谢酶活性及其关键基因表达量之间在不同生育时期均有不同程度的联系。综上，威宁黑石地区4月20日移栽，有利于碳代謝活动的进行。

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