隐匿性乙型肝炎病毒感染的输血传播风险及防范

王全慧,潘 彤 综述,樊 晶审校

天津市血液中心,天津 300110

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是世界卫生组织(WHO)公认的判断乙型肝炎病毒(HBV)感染的关键指标,也是大多数国家用于血液筛查、临床诊断的重要指标。随着分子生物学诊断应用于HBV DNA检测,部分献血者HBsAg检测阴性,但体内却仍然存在较低水平的HBV DNA。基于其隐匿性的特点,隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)者不容易被早期发现和治疗,导致感染者隐匿性肝损伤。本文就OBI的概念、发生的分子机制、输血传播风险及防范等方面逐一进行综述。

1 OBI概述

OBI定义为排除HBV感染的窗口期,肝脏存在有复制能力的HBV DNA[即游离型共价闭合环状DNA(cccDNA)]和(或)血液中存在HBV DNA。尽管OBI患者在肝脏中存在活跃的HBV DNA复制,但血液中的HBsAg为阴性,HBV DNA只能间歇性检测到。根据HBV特异性抗体谱,OBI可分为血清学阳性的OBI即乙型肝炎核心抗体(抗-HBc)和(或)乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)阳性,以及血清学阴性的OBI即抗-HBc和抗-HBs阴性。此外,还有一个OBI患者亚组被称为“假OBI”,这是HBsAg突变的携带者,但在一些常规检测方法中无法识别。这些病例表现出HBV DNA水平升高,类似于在HBsAg阳性的HBV感染中发现的DNA水平[1]。这些患者被S基因突变的变异株感染,被称为“逃逸变异”。

OBI的诊断是基于HBsAg阴性个体血液标本或肝组织中HBV DNA的检测。肝脏标本中HBV DNA的检测结果为金标准。研究发现,HBV DNA一般仅在血清/血浆中间歇性地检测到,通常小于200 IU/mL(约1 000 copy/mL)。但事实上,在超过90%的OBI受试者中,血清HBV DNA仅为20 IU/mL左右。

2 OBI发生的分子机制

2.1病毒因素 HBV是高度变异的DNA病毒,基因突变频繁发生。首先HBsAg主要亲水区(MHR,aa100～169)尤其是a 抗原决定簇(aa124～147)发生的点突变与OBI形成密切相关,且存在较高的突变频率。第二,S区的突变与HBV表面蛋白的表达减少有关;在OBI患者中经常观察到preS1/preS2启动子突变,使得HBsAg无法被检测到。第三,在OBI患者中发现剪接步骤对HBV中的基因表达也有关键影响。第四,表观遗传学修饰可以在不改变其核苷酸序列的情况下改变基因的表达模式[2]。在HBV双链 DNA启动子区和增强子区含有3个主要的 CpG 岛[3],一般呈非甲基化状态,一旦出现甲基化则导致基因转录的沉寂。

2.2宿主因素 HBV cccDNA以微小染色体形式稳定地存在于肝细胞核中。由于肝细胞较长的半衰期,一旦感染HBV即使发挥有效的免疫控制,病毒也可能会携带终生。绝大多数OBI患者的肝脏中HBV cccDNA水平较低,但对其HBV病毒株进行体外培养时发现,cccDNA 可完全恢复复制、转录和合成蛋白的能力。在宿主控制OBI过程中,除了T细胞免疫,B细胞体液免疫反应也起很重要的作用。在接受B细胞选择性单克隆治疗(例如利妥昔单抗和非肿瘤单抗)的患者中可频繁地观察到HBV再激活[4]。

2.3共同感染 研究显示,在合并其他病毒感染的情况下,HBV 的复制表达可能会被影响。特别是感染丙型肝炎病毒(HCV),核心蛋白通过与HBX蛋白和聚合酶之间的相互作用来抑制HBV基因表达和复制[5],HCV的非结构蛋白2(NS2)及NS5A也会干扰HBV的复制,从而导致OBI感染发生。

3 不同人群中OBI流行率

OBI 在世界上广泛存在,在 HBV 流行率高的地区,献血人群中 OBI 的流行率也较高。有研究发现英格兰献血者 OBI 流行率极低,小于0.001%[6]。在美国、中欧、北欧和地中海区域等国家献血者中OBI流行率为0.002%～0.070%[7-9]。西太平洋和亚马逊地区的HBV流行率要高于欧美地区[10]。据巴西、阿根廷、日本、东南亚国家等报告,献血者OBI流行率为0.012%～2.6%[11]。撒哈拉以南非洲地区的HBV流行率在非洲最高[12-16]。我国幅员辽阔,人口众多,是HBV高发区。HBV感染流行率越高的人群往往会有越多的OBI患者。江苏省、安徽省、河南省及山东青岛等省市最近几年内的报道数据显示献血者OBI的流行率为0.017%～0.054%[17-20],低于上海、云南、重庆、 浙江温州等南方地区的数据[21-24]。

最近,南京医科大学第一附属医院徐华国团队发表了一项关于全球OBI流行率的荟萃分析,结果显示:一般人群中OBI总流行率为0.82%,艾滋病患者中为16.26%,其他肝病患者中为13.99%,血液透析患者中为4.25%,有其他风险因素的患者中为5.14%[22]。

4 OBI引发输血后HBV感染的风险

HBsAg阴性而HBV DNA阳性的血液成分是具有传染性的,可通过输血途径传播并在临床得到了确认,但仍是极少报道的事件。在CANDOTTI等[26]的一项研究中,斯洛文尼亚3例HBsAg阴性重复献血者使用高度敏感核酸检测(NAT)未发现HBV DNA,31例受血者输注了其血液及血液成分,其中有9例受血者(29%)被确定为感染了HBV。但如果排除7例抗-HBs阳性的受者,感染比例增加到37.5%。有研究认为OBI是输血传播链上不可忽视的传染源,可通过输血传播感染[27]。最近开发了一个数学模型来估计与OBI相关的输血残余传播风险,该模型基于随机选择的OBI供体中病毒载量的概率分布,给定的病毒载量未被NAT检测到的概率,以及该病毒载量导致受体感染的概率,该模型估计单人份核酸检测(ID-NAT)(95%LOD:3.4 IU/mL)检测阴性的OBI献血者血液可能使受血者输注含有20 mL血浆的红细胞而导致感染的概率为3.3%,输注200 mL新鲜冰冻血浆而导致感染的概率估计增加到14%[28]。

5 OBI输血传播风险防范

5.1检测HBsAg的超敏方法 HBsAg检测血清学方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA),这是血液筛查最常用的检测方法。目前大多数试剂检测下限为50 mIU/mL。最近开发了具有更高灵敏度的测定HBsAg的检测方法,结合化学发光酶免疫分析法(CLEIA)和免疫复合物转移方法的半自动免疫分析系统(ICT-CLEIA),检测限为0.5 mIU/mL。这种检测方法可用于自限性HBV患者,识别cccDNA转录活性和最小HBV复制,以检测OBI。SHINKAI等[29]对120例接受全身化疗的血液病患者进行的一项研究显示:通过HBV DNA检测发现有13例患者存在HBV的再活化。ICT-CLEIA试验在这13例出现HBV再激活的患者中检测到12例HBsAg阳性,甚至有2例HBsAg阳性出现在HBV DNA升高之前。因此,ICT-CLEIA检测方法成为一种新的超灵敏的HBsAg检测方法,并可能将窗口期(WP)降低至14 d。

HBsAg试剂除了具有高灵敏度外,对检测S区逃逸变异的能力也不同。为了对这些变异进行最佳检测,HBsAg检测必须使用针对HBsAg多个表位的抗-HBs探针的检测方法,以确保检测到HBV S变异。此外,HBsAg检测失败的另一个原因可能是抗-HBs存在时,HBsAg-HBsAb免疫复合物的形成。在这种情况下,如果使用能够将HBsAg从免疫复合物中分离出来的方法检测,一些OBI患者可能会发现HBsAg呈阳性[30]。

5.2抗-HBc筛查 抗-HBc与HBV感染相关,是HBV感染后最早出现的特异性抗体。对献血者、器官捐献者、接受免疫抑制剂治疗的个体进行流行病学调查时,抗-HBc 检测可用作诊断OBI的替代血清学标志物。研究发现在HBsAg阴性和抗-HBc阳性的人群中,有0%～4.6%检测到HBV DNA,中位患病率为1%。在HBV感染低流行国家根据流行病学背景,酌情实施抗-HBc筛查。在加拿大、法国、德国、爱尔兰、荷兰和美国等一些中等/低流行国家,普遍的抗-HBc筛查造成的献血者损失是可以承受的[31]。另外一些国家为了减少献血源流失,在抗-HBc中引入抗-HBs检测,但目前对100 mIU/mL这个阈值还没有达成一致。日本抗-HBs要求大于200 mIU/mL,加拿大为100 mIU/mL。我国是HBV高流行国家,为了防止献血源的大量流失,未将抗-HBc筛查列入常规检测项目。但基于我国新生儿乙肝疫苗普遍接种近30年,将来在青年队伍中开展献血筛查时可考虑增加抗-HBc检测。

5.3MP-NAT/ID-NAT筛查模式灵敏度差异 目前,我国采供血机构普遍采用HBsAg和MP-NAT/ID-NAT筛查来防止HBV输血传播。美国学者的一项关于献血者综合研究表明,在404例确认OBI献血者中,MP-NAT混样检测只检测出43例(43/404,10.6%),大多数OBI献血者(361/404,89.4%)只能通过ID-NAT检测出[32]。MP-NAT为6或8个供体血浆混合标本检测模式,混样过程中引入的稀释因子降低了HBV NAT的灵敏度,所以即使进行NAT筛查后,OBI献血者仍然对血液安全构成潜在的威胁。另外,YE等[33]研究中还观察到MP-NAT检测阳性的42个pool,拆分检测时未检出阳性标本,当使用定量PCR(qPCR)和巢式PCR检测时,17份标本被确定为OBI。在低流行的发达国家,HBsAg、抗-HBc和HBV NAT的实施提供了最佳的血液安全水平,能筛查出急性感染的早期阶段,可检测到潜在的间歇性病毒血症的隐匿性感染以及病毒变异。此外,在中度和高流行率国家由于抗-HBc还不能实施,ID-NAT应该是首选。

5.4血液制品的病毒灭活 对血液制品进行病毒灭活是保证输血安全的另一道防线,是输血领域研究的热点。OBI通过输血方式传播HBV是一项重要的公共卫生问题,即便在发达国家也存在输血传播的风险,因为导致人类HBV感染的最低病毒载量低于当前使用的最敏感NAT的检测下限。在血液制品制备过程中或者临床输血前实施病原体灭活程序,既能保障血液成分又能降低感染性疾病传播的概率,可以最大程度上保证输血安全性。目前国内采供血机构广泛使用的有亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活技术。亚甲蓝是一种光敏剂,可以与病毒的核酸以及病毒的脂质包膜相结合,在可见光的作用下发生化学反应,使病毒的核酸断裂,包膜结构破损,从而达到病毒灭活的效果。病原体灭活技术不仅能有效灭活血浆中常见的重要病毒如HBV、HCV、人类免疫缺陷病毒和人类T细胞白血病病毒(HTLV)等,也被证实可以有效去除包括西尼罗病毒(WNV)、登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZKV)以及新型冠状病毒(SARS)。在发达国家,病原体灭活技术目前应用于新鲜冰冻血浆和血小板浓缩物,但仍无法用于红细胞浓缩物。对经过处理后血液成分功能方面的影响,也存在一些争议。

6 OBI对乙肝消除战略的挑战

2016年,WHO通过了《全球卫生部门战略》,旨在到2030年消除病毒性肝炎。WHO的目标是到2030年将肝炎发病率减少到90万例,并将每年因肝炎死亡的人数从140万例减少到50万例。为此目的,WHO正在帮助不同的国家制定肝炎控制规划。文件列出了到2030年消除肝炎的5个领域,其中大多数以HBV为目标。重点领域如下:(1)扩大针对HBV的疫苗接种覆盖率及实行病原体减少程序;(2)预防HBV性传播;(3)减少静脉注射传播;(4)降低OBI伤害和减少合并感染;(5)扩大对HBV和HCV的检测和治疗。除了增加预防性疫苗接种的覆盖率之外,WHO还建议增加对HBV感染的早期诊断和治疗。提高HBsAg检测诊断的灵敏度也将有助于检测“假OBI”,检测HBV DNA最敏感的方法通常用于血液筛查。在与OBI和消除HBV有关的主要挑战中,有以下几方面的需求:开发检测OBI的灵敏度更高、特异度更高和标准化的检测方法;可以通过筛查抗-HBc、HBV DNA(0.15 IU/mL)或病原体减少法处理血液成分来提高血液安全性;开发出旨在消除cccDNA及其相关表观遗传变化的治疗方法,以减少临床进展和OBI传播。

7 总 结

我国是HBV感染高流行地区,OBI在输血安全中的隐患不容忽视,在献血人群中潜在相当数量的OBI患者,对输血安全造成极大威胁。目前还存在以下3方面问题:(1)国外已经对OBI献血者造成感染的临床病例进行了深入研究,但目前我国OBI献血者造成的输血传播风险尚无临床数据,需要采供血机构联合临床用血单位开展输血后风险评估的研究,监测OBI引发的输血传播风险。(2)同时也应该开发更灵敏、标准化和经过验证的检测HBsAg的方法,包括检测 HBV S变异体和存在抗-HBs免疫复合物中的HBsAg。(3)提高核酸检测灵敏度。防止输血传播HBV所需的NAT灵敏度需要从目前的3.4 IU/mL降低到一个新的检测下限(0.15 IU/mL)。实施有效的血液安全监测体系,包括系统地收集和长期存储患者的输血前血浆标本,用于HBV传播监测和患者的治疗管理。OBI感染者情况错综复杂,应该综合各种检测技术对献血者的血液质量进行全方位的监测、评估,以保证临床用血安全。