乳酸菌计数能力验证的结果与分析

摘 要：为了展示实验室具备乳酸菌计数的检测能力，加强实验室质量控制，提高实验室检验结果的可信度。本实验室参加英国政府化学家实验室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）组织的能力验证。参照LGC方提供的检测作业指导书和《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）对测试样品进行检验，最终报送结果为8.2×104 CFU·g-1，得出Z值为0.44，反馈为满意。由此可知，实验室具备对乳酸菌计数的检测能力。

关键词：能力验证；乳酸菌；质量控制

Results and Analysis of Lactic Acid Bacteria Count Ability Verification

LIU Qiuting， CHEN Peihong

（Guangdong Provincial Institute of Food Inspection， Guangzhou 510435， China）

Abstract： In order to show that the laboratory has the detection ability of lactic acid bacteria count， the quality control of the laboratory is strengthened to improve the credibility of the laboratory test results. The laboratory participated in the capability verification of laboratory of the government chemist （LGC）. The test samples were tested according to the test instructions provided by LGC and GB 4789.35—2016， and the final reported result was 8.2×104 CFU·g-1， with a Z value of 0.44， and the feedback was satisfactory. It can be seen that the laboratory has the ability to detect the lactic acid bacteria count.

Keywords： ability verification; lactic acid bacteria; quality control

乳酸菌属是一类无芽孢，呈革兰氏阳性，分为需氧型和厌氧型，主要发酵各种碳水化合物（主要为糖类），释放能量并生成大量乳酸的微生物。它对酸类和胆盐有较强的耐受性，但在高温、高浓度的胃酸和一些消化酶等的作用下容易失活[1-2]，主要存在于发酵乳制品、动物体肠道、人体肠道、饲料，以及其他食品中。乳酸菌在微生物界中普遍存在，绝大部分寄居在动、植物体中[3-5]，它们对抗生素有一定的耐药性[6]，能维持肠道微生物的平衡，改善肠胃功能，具备抗氧化、促进和加强人体免疫系统、防止食品腐败的作用。此外，潘慧青等[7]、刘延英等[8]的研究中表明，该菌可以去除恶臭，可以促进生产性能。在食品界中，乳酸菌主要被用于酸奶、酱腌菜、保健食品、婴幼儿配方奶粉和辅食、啤酒等中，另外在工业、农业、医学界等领域乳酸菌都发挥重要作用，说明乳酸菌的存在与人类的生活息息相关。

为了提高实验室的乳酸菌计数检测能力和检验员的检验水平，实验室参加了英国政府化学家实验室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）实验室举办的乳粉中乳酸菌计数能力验证活动。

1 材料与方法

1.1 样品

LGC实验室提供的乳粉样品，样品编号为PT-MC-24D。

1.2 仪器设备

超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；均质器（IUL）；显微镜（卡尔蔡司）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；厌氧罐（日本三菱化学）；质谱仪（梅里埃公司）。

1.3 试剂

生理盐水（北京陆桥）；MRS琼脂培养基（北京陆桥）；莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS培养基（北京陆桥）；MC培养基（广东环凯）；革兰氏染色液（广东环凯）。

1.4 方法

待测乳粉样品的水化方法按照英国LGC实验室提供的乳酸菌计数的作业指导书进行处理，后续检验流程和数据处理按《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）操作。

1.4.1 样品处理

实验前先对10 g样品进行水化处理，于4 ℃冰箱中取出样品，使其恢复至室温（约30 min），准备

90 mL灭菌的0.85%生理盐水。在紫外线照射过的超净工作台进行实验，先用酒精棉球擦拭样品瓶口，开启瓶盖，用移液枪从90 mL的灭菌生理盐水中吸取20 mL加入样品瓶进行水化溶解，待充分混匀后移到另一无菌瓶中，剩余的无菌生理盐水按以上操作重复清洗样品瓶，转移到无菌瓶中，此时的待测液体相当于10-1的乳粉样品。

1.4.2 样品稀释

将样液混匀后吸取25 mL到225 mL生理盐水均质袋中，拍打1～2 min，制成10-2稀释液。吸取1 mL 10-2稀释液到9 mL生理盐水试管中，混匀制成10-3样品稀释液。按上述操作到10-5梯度为止，每个稀释度吸取1 mL样品液于平皿内，每个梯度做3种菌属，分别为乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌，每种菌属做2个平行。

1.4.3 平板倾注和培养

将MRS培养基、MC培养基按121 ℃，20 min高压灭菌后冷却到适宜温度，将一半的MRS培养基加莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐配套试剂，制成改良MRS培养基，每个平皿倾注20～25 mL培养基使其覆盖均匀。

观察到平皿凝固后，将改良MRS平板，MRS平板倒置于厌氧罐，放置厌氧包36 ℃±1 ℃培养72 h±2 h，MC平板倒置于36 ℃±1 ℃培养箱中培养，培养72 h±2 h后计数。

1.4.4 镜检

挑取平板上的单菌落进行镜检，乳杆菌为革兰氏阳性，呈长杆状、弯曲杆状等，无芽孢。嗜热链球菌菌体呈球状，成对或成链排列，无芽孢，为革兰氏染色阳性。

2 结果与分析

2.1 计数

实验结果见表1、表2。检验员①和②在相同的实验条件下对样品进行独立实验，改良MRS平板数为零，计数方法为选取10-3梯度MRS平板和MC平板上的菌落数。参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）中6.3.1和6.4.1选取10-3稀释度进行计算。分别计算MRS平板、MC平板上的菌落数的平均值，乘以相应稀释倍数，再将两者的总数相加，作为每克乳粉中乳酸菌总数结果。按照《食品和动物饲料微生物学 30 ℃菌落计数方法》（SN/T 1800—2006）[9]要求，两者的绝对差值为0.13，小于复现性限R值0.45，说明实验人员的检测结果符合再现性要求。

2.2 结果评定

能力验证评定方式采用CNAS—GL002：2018中4.5条款“Z比分数”[10]进行评价：|Z|≤2，表明结果满意；2＜|Z|＜3，表明结果有问题；|Z|≥3，表明结果不满意。依据组织方反馈的中位值4.76，标准差0.35，算出人员①和人员②的|Z|值分别为0.80和0.44，两者结果都小于2，说明本实验室检验人员具备在乳酸菌计数领域的检测能力。

（1）

式中：χ为检验人员的检测数值（对数值）；X为中位值；σ为标准差值。

3 结论与讨论

乳酸菌主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属和嗜热链球菌属，PT-MC-24D样品在改良MRS平板生长数为零，说明未添加双歧杆菌属，乳粉中的乳酸菌仅包括乳杆菌属和嗜热链球菌属，即乳酸菌总数为MRS平板和MC平板总数之和，按照GB 4789.35—2016对乳杆菌和嗜热链球菌进行计数。由表1和2可知，人员①和人员②两者对数的差值小于复现性限R值0.45，说明两个实验结果是在可接受范围内，结果有效，基于检验员②操作熟练，实验过程无误差，实验数据平行性较好，综合报送结果为8.2×

104 CFU·g-1。经能力验证提供者反馈，PT-MC-24D乳酸菌总数|Z|＜2，结果满意。人员比对指在同一时段，由两名检验人员采用相同的仪器设备和检验方法对同一测试样品进行实验，通过实验数据的差异分析“人、机、料、法、环”5个环节，从中识别产生不符合项问题的原因，并找到解决问题的方法。本次采取这种质控方式是为了评价监控在岗人员技术能力，增加结果的可靠性。

通过分析本次能力验证检测过程，总结了乳酸菌计数的几个质量控制点。①样品管理。在接收样品后应检查标签和包装的完整性，按照说明书放置

-4 ℃冰箱中冷藏并及时进行实验，有问题及时反馈给能力验证组织方。②样品处理。定量计数的样品在进行水化时要恒温到室温方可进行实验，以免升温过快造成菌体破裂[11]，导致结果偏低。样品均质时要在1～2 min完成，以免样品溶解不彻底影响计数结果。③稀释过程。此过程检验员应独立进行无菌操作，严格按照比例进行样液稀释，自行分装

9 mL和225 mL无菌稀释液，减少因高压灭菌后稀释液体积减少带来的误差。④培养基配制。实验所用的试剂和培养基应按照GB 4789.28—2013标准要求进行验收。培养基配制应按试剂供应商的配制要求，称量加水溶解干粉后应在电热板上进行加热，充分溶解后高压灭菌，保证溶液体系均匀性和倾注平板后菌落生长良好，增加计数的稳定性。⑤操作时间。由于微生物增长速度过快，还易受其他环节交叉污染，因此稀释样液到平板倾注过程应在15 min内完成。⑥培养条件。乳杆菌和双歧杆菌都是厌氧的革兰氏阳性菌，须在无氧环境下生存，所以要改良MRS平板。MRS平板倒置培养时应在厌氧罐放置厌氧包并密封，如培养过程密封性不好则需及时更换厌氧包继续培养至72 h。

按照《能力验证规则》（CNAS—RL02：2023）[12]4.1总则要求，参加能力验证是检验机构的责任和义务，需考虑实验室在某些项目取得资质要求，按内外部质控计划安排参加能力验证，评估实验室能力。只有持续性参加外部实验室能力验证活动才能识别实验室存在的风险问题，确认与其他检验检测实验室的差距，提升实验室检验员的能力，从而使实验室整体检验水平不断提高。

参考文献

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[12]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则：CNAS—RL02：2023[EB/OL].（2023-09-30）[2023-12-23].http：//down.foodmate.net/standard/yulan.php？itemid=147018.

作者简介：刘秋婷（1995—），女，广东潮州人，本科，助理工程师。研究方向：食品微生物检验。