lncRNA DANCR靶向调控miR-193a-3p表达对缺氧诱导的神经细胞氧化损伤的影响

宋海英 李红霞 王逍

摘要  目的：探讨长链非编码RNA（lncRNA）DANCR对缺氧诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12氧化损伤的影响及其可能作用机制。方法：选取榆林市星元医院于2019年10月—2021年10月就诊的缺血性脑卒中病人40例为疾病组，以同期30名健康体检者为正常组，检测lncRNA DANCR、miR-193a-3p表达量，Pearson法分析血清lncRNA DANCR与miR-193a-3p的相关性；建立缺氧诱导的PC12细胞损伤模型，si-NC、si-DANCR、miR-NC、miR-193a-3p mimics分别转染至PC12细胞后缺氧处理24 h，si-DANCR＋anti-miR-NC、si-DANCR＋anti-miR-193a-3p分别共转染至PC12细胞后缺氧处理24 h；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测lncRNA DANCR、miR-193a-3p表达量；试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性；用凋亡试剂盒检测凋亡率；双荧光素酶报告实验检测lncRNA DANCR、miR-193a-3p靶向关系；蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达量。结果：血清中lncRNA DANCR与miR-193a-3p表达呈负相关。缺氧处理后，PC12细胞中lncRNA DANCR表达量升高（P＜0.05），miR-193a-3p表达量降低（P＜0.05）；分别与转染si-NC或miR-NC比较，转染si-DANCR或miR-193a-3p mimics后，缺氧诱导的PC12细胞LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）；与共转染si-DANCR＋anti-miR-NC比较，共转染si-DANCR＋anti-miR-193a-3p后，缺氧诱导的PC12细胞LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白水平升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）。结论：干扰lncRNA DANCR可通过促进miR-193a-3p表达而抑制氧化应激、细胞凋亡，从而减轻缺氧诱导的PC12细胞损伤，血清中lncRNA DANCR、miR-193a-3p水平对缺血性脑卒中病人具有预测价值，且联合诊断价值更高。

关键词  缺氧；长链非编码RNA DANCR；miR-193a-3p；神经细胞；氧化应激；细胞凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.013

作者单位  1.榆林市星元医院（ 陕西榆林  719000）；2.陕西中医药大学附属医院（陕西咸阳  712000）

通讯作者  王逍，E-mail：459403867@qq.com

引用信息  宋海英，李红霞，王逍.lncRNA DANCR靶向调控miR-193a-3p表达对缺氧诱导的神经细胞氧化损伤的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（2）：279-285.

缺血性脑卒中属于脑血管疾病，我国缺血性脑卒中发病率、死亡率逐年上升，严重影响病人生活质量，脑组织缺氧、缺血可促进神经细胞损伤进而诱发神经功能障碍［1］。长链非编码RNA（lncRNA）可调节细胞分化、代谢等生理过程，并可在脑血管疾病发生中发挥调控作用［2］。已有研究表明，lncRNA MALAT1在缺氧诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12中表达量增加，并可促进细胞凋亡、氧化应激［3-4］。lncRNA DANCR在葡聚糖硫酸钠诱导的肠上皮细胞中表达上调，并可增加白细胞介素（IL）-1β、IL-6表达量、细胞凋亡率从而引起细胞损伤［5］。但lncRNA DANCR与脑血管疾病相关研究相对较少。StarBase预测显示，lncRNA DANCR、miR-193a-3p存在结合位点。有研究表明，miR-193a-3p在高糖诱导的人视网膜内皮细胞损伤中表达降低，上调其表达可减轻高糖诱导的人视网膜内皮细胞凋亡［6］。目前lncRNA DANCR、miR-193a-3p在缺氧诱导的PC12细胞损伤中的研究尚未见报道。因此，本研究主要探究lncRNA DANCR/miR-193a-3p是否介导缺氧诱导的PC12细胞损伤过程。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

上海通派生物科技有限公司提供大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12；美国Thermo Fisher公司提供Lipofectamine 2000、Trizol、反转录试剂盒；北京天根生化科技有限公司提供miRNA提取、SYBR Green试剂盒；上海吉玛制药技术有限公司提供si-NC、si-DANCR、miR-NC、miR-193a-3p mimics、pcDNA、pcDNA-DANCR、anti-miR-NC、anti-miR-193a-3p；南京建成生物工程研究所提供乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒；上海爱必信生物科技有限公司提供凋亡检测试剂盒；美国Promega公司提供野生型载体WT-DANCR、突变型载体MUT-DANCR；北京索莱宝公司提供荧光素酶活性检测试剂盒；美国Abcam公司提供实验所需cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗及二抗。

1.2  方法

1.2.1  一般资料

选取2019年10月—2021年10月于榆林市星元医院就诊的缺血性脑卒中病人40例为疾病组，均为我院依据相关标准确诊的缺血性脑卒中病人，其中男18例，女22例；年龄45～68（61.65±3.72）岁；另选取30名同期健康体检者作为正常组，男12名，女18名；年龄44～71（63.55±1.52）岁。研究对象性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。分别采集40例病人及30名健康体检者空腹静脉血6 mL，离心分离血清后保存至－80 ℃待测。

1.2.2  实验处理及分组

PC12细胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养，记为对照组。依据细胞密度不同分别接种于6孔板（1×105个/孔）、96孔板（2×103个/孔），放入缺氧培养箱（37 ℃、4%CO2体积分数、95%N2、1%O2）内缺氧处理24 h［7］，记为缺氧组。si-NC、si-DANCR、miR-NC、miR-193a-3p mimics用Lipofectamine 2000分别转染至PC12细胞，转染48 h，缺氧处理24 h，分别记为缺氧＋si-NC组、缺氧＋si-DANCR组、缺氧＋miR-NC组、缺氧＋miR-193a-3p组。si-DANCR与anti-miR-NC、si-DANCR与anti-miR-193a-3p用Lipofectamine 2000分别共转染至PC12细胞，转染48 h，缺氧处理24 h，分别记为缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-NC组、缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-193a-3p组。

1.2.3  实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测血清及细胞中lncRNA DANCR、miR-193a-3p的表达水平

用Trizol试剂、miRNA提取试剂盒分别提取细胞总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA，qRT-PCR反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，双蒸水（ddH2O）补足体系至20 μL。GAPDH表达量作为lncRNA DANCR内参，U6表达量作为miR-193a-3p内参，2－ΔΔCt法分析lncRNA DANCR、miR-193a-3p相对表达量。

1.2.4  检测LDH漏出率、MDA含量、SOD活性

收集1.2.2实验分组PC12细胞，参照试剂盒说明书检测LDH水平，并检测细胞吸光度（OD），计算LDH漏出率。将1.2.2中实验分组PC12细胞分别接种于24孔板后弃培养基，加入裂解液裂解细胞，用试剂盒检测上清液中MDA含量、SOD活性。

1.2.5  流式细胞术检测细胞凋亡率

取各组PC12细胞接种于6孔板，弃培养基，胰蛋白酶消化，取细胞悬液（1×105个/mL），离心（1 000 r/min）10 min，弃上清，膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-异硫氰酸荧光素（FITC）、碘化丙啶（PI）分别染色，流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.6  验证lncRNA DANCR、miR-193a-3p的靶向关系

双荧光素酶报告实验：WT-DANCR/MUT-DANCR与miR-NC、miR-193a-3p mimics用Lipofectamine 2000分别共转染至PC12细胞，培养48 h，试剂盒检测荧光素酶活性。qRT-PCR实验：si-NC、si-DANCR、pcDNA、pcDNA-DANCR用Lipofectamine 2000分别转染至PC12细胞，培养48 h，qRT-PCR法检测miR-193a-3p相对表达量。

1.2.7  蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达量

RIPA裂解液提取PC12细胞蛋白，蛋白、上样缓冲液充分混匀，沸水内放置5 min。在每个泳道上加入40 μg蛋白后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），采用常规湿法将蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，与稀释的一抗［cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、cleaved-Caspase-9（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）］4 ℃反应24 h，与稀释的二抗（1∶3 000）37 ℃结合1 h，以GAPDH为内参，采用Quantity One软件对蛋白条带进行定量。

1.3  统计学处理

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据。定量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义；采用Pearson相关分析法分析缺血性脑卒中病人lncRNA DANCR、miR-193a-3p表达的相关性。

2  结  果

2.1  疾病组与正常组血清lncRNA DANCR和miR-193a-3p表达比较

与正常组相比，疾病组血清lncRNA DANCR表达增加，miR-193a-3p表达降低（P＜0.05）。详见表1。

2.2  血清中lncRNA DANCR和miR-193a-3p的相关性

Pearson相关分析结果显示，缺血性脑卒中病人血清lncRNA DANCR和miR-193a-3p呈负相关（r＝－0.365，P＜0.05）。详见图1。

2.3  血清lncRNA DANCR和miR-193a-3p水平对缺血性脑卒中的预测价值

血清lncRNADANCR、miR-193a-3p水平预测缺血性脑卒中病人的曲线下面积分别为0.888、0.853，特异度分别为83.33%、73.33%，敏感度分别为82.50%、82.50%，最佳截断值分别为0.84、0.59；二者联合预测缺血性脑卒中病人的曲线下面积、特异度、敏感度分别为0.917、83.33%、87.50%。详见图2。

2.4  lncRNA DANCR和miR-193a-3p在缺氧诱导的神经细胞损伤中的表达

与对照组比较，缺氧组lncRNA DANCR表达量升高（P＜0.05），miR-193a-3p表达量降低（P＜0.05）。详见表2。

2.5  干扰lncRNA DANCR表达对缺氧诱导的神经细胞氧化损伤的影响

与对照组比较，缺氧组LDH漏出率、MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与缺氧＋si-NC组比较，缺氧＋si-DANCR组LDH漏出率、MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达水平降低（P＜0.05）。详见图3、表3。

2.6  lncRNA DANCR靶向调控miR-193a-3p的表达

lncRNA DANCR、miR-193a-3p存在互补序列，详见图4。miR-193a-3p过表达可降低野生型载体WT-DANCR荧光素酶活性（P＜0.05），而对突变型载体MUT-DANCR荧光素酶活性无明显影响。详见表4。与si-NC组比较，si-DANCR组miR-193a-3p表达量升高（P＜0.05）；与pcDNA组比较，pcDNA-DANCR组miR-193a-3p表达量降低（P＜0.05）。详见表5。

2.7  miR-193a-3p过表达对缺氧诱导的神经细胞氧化损伤的影响

与缺氧＋miR-NC组比较，缺氧＋miR-193a-3p组LDH漏出率、MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达水平降低（P＜0.05）。详见图5、表6。

2.8  下调miR-193a-3p表达逆转了干扰lncRNA DANCR表达对缺氧诱导的神经细胞氧化损伤的作用

与缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-NC组比较，缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-193a-3p组LDH漏出率、MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达水平升高（P＜0.05）。详见图6、表7。

3  讨  论

lncRNA作为内源性长链非编码RNA分子，其作用机制主要为lncRNA含有miRNA结合位点，一个lncRNA包含多个miRNA的反应元件，并可通过充当miRNA竞争性内源RNA（ceRNA）而影响miRNA靶基因表达，该机制在细胞增殖、凋亡等生物学过程中具有重要调控作用，并可参与神经细胞损伤过程［8-10］。

lncRNA DANCR在氧糖剥夺诱导心肌细胞损伤中表达水平升高，lncRNA DANCR直接与miR-19a-3p结合，敲低lncRNA DANCR可促进心肌细胞增殖、抑制细胞凋亡［11］。lncRNA DANCR表达下调可降低氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的血管平滑肌细胞炎性细胞因子水平并减少细胞凋亡［12］。骨折病人血清中lncRNA DANCR表达明显升高，干扰lncRNA DANCR可促进成骨细胞系的增殖和分化［13］。lncRNA DANCR在缺氧诱导的PC12细胞损伤中的作用机制尚未明确。本研究结果显示，缺血性脑卒中病人血清及缺氧条件下PC12细胞中lncRNA DANCR表达上调，提示lncRNA DANCR可能促进神经细胞损伤，引发神经功能障碍，在缺血性脑卒中发生、发展中发挥作用。LDH、MDA属于氧化酶，SOD属于抗氧化酶，SOD可清除负氧离子而保护细胞免受损伤［14］。本研究结果显示，缺氧诱导的PC12细胞LDH、MDA水平升高，SOD活性降低，而干扰lncRNA DANCR可降低LDH、MDA水平，并可增强SOD活性，提示干扰lncRNA DANCR可抑制氧化应激而减轻细胞损伤。Caspase家族蛋白可参与脑组织损伤过程，cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9表达量增加可促进神经细胞凋亡［15］。本研究结果显示，缺氧诱导的PC12细胞凋亡能力增强，其主要通过激活Caspase-3、Caspase-9而促进细胞损伤，干扰lncRNA DANCR可减弱缺氧对PC12细胞凋亡的作用。提示干扰lncRNA DANCR可抑制缺氧诱导的PC12细胞凋亡。

本研究进一步证实lncRNA DANCR、miR-193a-3p存在靶向调控作用，lncRNADANCR可以充当miR-193a-3p ceRNA而抑制其表达。有研究表明，miR-193a-3p过表达可减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化损伤并抑制细胞凋亡［16］。miR-193a-3p在脂多糖（LPS）诱导的人胚肺成纤维细胞中表达下调，上调其表达可抑制细胞凋亡和炎症损伤［17］。然而，Jiang等［18］研究表明脓毒症致急性肺损伤中miR-193a-3p表达增加，并促进促炎细胞因子分泌量、细胞凋亡增加，降低细胞活力。表明miR-193a-3p在不同组织损伤中可发挥不同作用。本研究结果显示，缺血性脑卒中病人血清及缺氧诱导的PC12细胞中miR-193a-3p表达量降低，miR-193a-3p过表达可抑制细胞氧化应激、减少凋亡，而下调miR-193a-3p可降低干扰lncRNA DANCR对细胞氧化应激、凋亡的作用，且血清lncRNA DANCR与miR-193a-3p表达呈明显负相关，提示lncRNA DANCR/miR-193a-3p可介导缺氧诱导的PC12细胞损伤过程，且血清lncRNA DANCR、miR-193a-3p水平对缺血性脑卒中具有预测价值，且联合诊断价值更高。

综上所述，干扰lncRNA DANCR可通过靶向调控miR-193a-3p而抑制氧化应激、细胞凋亡，从而抵抗缺氧诱导的PC12细胞损伤，lncRNA DANCR对神经细胞的作用与miR-193a-3p密切相关，为进一步阐释缺血性脑卒中的分子机制奠定实验基础，lncRNA DANCR可能是缺血性脑卒中潜在治疗靶点。但lncRNA DANCR/miR-193a-3p如何调控下游靶基因表达而参与神经细胞损伤过程仍需进一步探究。

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（收稿日期：2022-06-13）

（本文编辑王丽）