碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌的耐药机制及抗菌药物的研究进展

刘洁，赵建平

(1 内蒙古医科大学内蒙古临床医学院，呼和浩特 010050;2 内蒙古自治区人民医院检验科，呼和浩特 010010)

多重耐药菌(Multi-drug resistent organisms，MDRO)是指同时对三种或三种以上临床使用的抗菌药物耐药的细菌[1]，多重耐药已经成为威胁人类公共卫生的重要问题。碳青霉烯类抗生素是一类非典型的β-内酰胺类药物，是目前抗菌谱最广、杀菌活性最强的抗生素，是一种细菌细胞壁合成的抑制剂，它们可通过抑制胞壁黏肽合成，使细菌胞壁缺损、细胞裂解和死亡，从而杀灭细菌[2]。此类抗生素对各种革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌、厌氧菌及多重耐药菌都具有较强的抗菌活性，特别是对超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases，ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)具有高度稳定性、低毒性的特点，是治疗严重细菌感染最重要的抗菌药物之一[3]。近年来，由于过量和不正确地预防性使用广谱抗菌药物、激素和细胞毒性类药物，尤其是一些合并多种疾病的老年患者，不合理用药情况更为常见，其中最需要关注的是碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌(Carbapenem-resistant organism，CRO)的出现[4]。CRO主要包括碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)、碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)和碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(Carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA)三种，已被确定为全球威胁严重的耐抗生素病原体[5]。随着此类抗生素的广泛使用，CRO在全球范围内扩散[6]，导致临床选择抗菌药物越来越艰难，给临床治疗带来了极大的挑战。亚胺培南于1985年首次上市，是第一个可用于治疗细菌感染的碳青霉烯类抗生素[7]。在随后的二十年里，几种碳青霉烯类抗生素被开发出来，现在临床上使用最多的碳青霉烯类是厄他培南、美罗培南、多利培南和亚胺培南[8]。然而，在它们使用后不到十年CRO就出现了。由于碳青霉烯类抗生素是首选抗生素，并且在许多情况下是多重耐药的最后治疗手段，CRO出现和传播是目前全球公共卫生的一个重大危机[9]。因此，在缺乏新抗生素和新治疗选择的情况下，加强对细菌耐药性监测，加深对细菌耐药机制的了解，合理地使用现有抗生素提高临床疗效，减少不良反应等策略，是控制CRO感染的主要手段。

1 CRO的耐药机制

细菌对碳青霉烯类耐药机制见表1，编码这些机制的基因存在于不同的可移动元件上具有高度的可传播性[21]，因此对抗菌治疗带来极大的威胁。

表1 碳青霉烯类药物的耐药机制

1.1 碳青霉烯酶的产生

常见的碳青霉烯酶根据Almber分类法根据β-内酰胺酶的中心催化结构域和底物偏好将其分为4类(即A、B、C、D)。其中，A类、B类和D类酶可水解碳青霉烯类药物活性被称为碳青霉烯酶，而C类酶它们对碳青霉烯类的水解活性很弱或不存在，但在外膜通透性降低的情况下，它们的过量产生可能导致碳青霉烯耐药[22]。A类、C类和D类酶为丝氨酸碳青霉烯酶是使用丝氨酸作为酶活性中心，B类酶是金属β-内酰胺酶(MBLs)而是使用金属锌作为酶活性中心[23]。

1.1.1 A类碳青霉烯酶

A类为丝氨酸蛋白酶，有染色体编码的(SME，NMC-A，SFC-1，Bicc-1，PEN-A，FPH-1，SHV-38)，质粒编码的(KPC，GES)，或两者都编码(IMI)，其中KPC在世界各地传播，并从肠杆菌目细菌尤其在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CarbapenemresistantKlebsiellaPneumoniae，CRKP)中检出，是CRKP耐药的主要原因。KPC的存在最初只在肺炎克雷伯菌分离株中，随后KPC在巴西的铜绿假单胞菌和中国及其他区域的鲍曼不动杆菌中均有发现[24]。目前发现的KPC亚型有20多种，以KPC-2、KPC-3最常见。我国于1996年[10]首次分离到KPC型菌株，此后主要以KPC型为主，随后其在全球范围内迅速传播。2014年携带 KPC-2型肠杆菌目细菌于土耳其一家医院发现。产生KPC的肺炎克雷伯菌在美国广泛存在，但在一些欧洲国家如希腊和意大利也被发现[25]，并引起世界范围内的许多重大疫情。除KPC型在世界范围内流行广泛外，其他各型偶尔可见。

1.1.2 B类β-内酰胺酶

B类β-内酰胺酶或金属β-内酰胺酶(MBLs)通常在肠杆菌目和铜绿假单胞菌中发现。到目前为止，已经报道了B类酶包括NDM、IMP、VIM、GIM和SPM酶等，其中NDM、VIM和IMP是全球最常被发现的酶[11]。2010中期年首次在肺炎克雷伯菌感染患者中检测到NDM，该菌株导致1名印度裔瑞典患者的尿路感染[26]，自此以后NDM迅速传播，这种金属酶型已成为全世界最主要的金属酶类型之一，主要见于肠杆菌目，特别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，不动杆菌属中也有少量发现，产IMP的革兰阴性菌主要分布在中国、日本和澳大利亚，以鲍曼不动杆菌为主。VIM型在欧洲和地中海地区检出率较高，主要由铜绿假单胞菌产生，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌也可产生[27]。

1.1.3 D类碳青霉烯酶

D类碳青霉烯酶是一种水解囊状酶又称苯唑西林酶(OXA)，是β-内酰胺酶的一个异质性群，具有显著的碳青霉烯酶活性。D类碳青霉烯酶的种类繁多以OXA-48和OXA-23为主，具有较强的水解活性，此类酶最早发现于鲍曼不动杆菌，也可见于肠杆菌目和非发酵菌中[12]。特别是OXA-48及其相关变异更具有临床意义，它们使治疗感染变得困难。有文献报道OXA型在鲍曼不动杆菌中最常见，我国鲍曼不动杆菌以OXA-23型为主[28]。2001年，在土耳其的肺炎克雷伯菌分离株中鉴定出OXA-48基因，其分离株具有超强毒力的遗传属性，并因其耐药性可导致严重感染且无法治疗[29]。另外，OXA酶水解碳青霉烯类抗生素的作用较弱，因此需要联合其他耐药机制。

1.2 外膜孔蛋白的缺失

孔蛋白[13,30]是指存在于细菌外膜的通道蛋白，它以跨膜β-桶蛋白的形式存在，营养物质和抗生素可通过该通道进入细菌，是一种非特异性跨膜蛋白，允许抗菌药物分子进入细菌内结合相应蛋白发挥作用，当细菌的菌体发生突变使外膜孔蛋白缺失或者减少时，最终导致抗菌药物分子进入菌体内的数量减少，从而导致细菌耐药[14]。孔蛋白可分为三类：抗生素转运相关的特异性孔蛋白(LamB和YddB等)、膜完整性相关的非特异性孔蛋白(OmpA)以及与抗生素转运和细胞膜完整性有关的孔蛋白(OmpC和OmpF)。不同的细菌通过不同的通道发挥作用，文献报道肺炎克雷伯菌的孔蛋白OmpK35和OmpK36对β-内酰胺类抗生素的作用优于大肠埃希菌的孔蛋白OmpF和OmpC，耐碳青霉烯大肠埃希菌表现为染色体携带的AmpC基因过度表达以及OmpC或OmpF4孔蛋白的改变，CRKP表现为OmpK35、36膜孔蛋白缺失，OmpK36突变[15-16]。

1.3 外排泵的过度表达

药物主动外排转运系统或外排泵是细菌膜上的一种蛋白质，外排泵系统的突变或过度表达可将抗菌药物及其代谢产物从细菌细胞内向外输出，从而导致细菌耐药性的发生[17]。目前已有6个与临床相关的外排泵家族：主要协助转运蛋白超(MFS)家族、小多重耐药转运分子(SMR)家族、ATP结合盒(ABC)家族、多药和有毒化合物排出(MATE)家族、蛋白杆菌抗菌化合物外排(PACE)家族和耐药结节分裂(RND)家族。其中RND超家族普遍存在于在革兰阴性杆菌中，其在耐药中发挥着重大作用如AcrAB-To1C系统可介导β-内酰胺类抗菌药物的耐药，被认为是不产碳青霉烯酶CRE的耐药机制；Cavalcanti等[18]报道MexAB-OprM和MexXY-OprM系统过表达可导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药和CRAB主要与RND超家族中AdeABC系统相关[17]。

1.4 药物结合位点的改变

青霉素结合蛋白(PBPs)位于细菌细胞内膜上，是具有催化作用的一类酶，也是β-内酰胺类抗生素的靶蛋白可与细胞内膜上的PBP靶点特异性结合，从而干扰细胞壁肽聚糖的形成，最终导致细菌溶解[5]。PBPs可分为两类：高分子量PBPs，主要负责肽聚糖聚合；低分子量PBPs，参与肽聚糖的成熟或循环[19]。PBPs的表达减少或突变导致MC值升高，突变可能在导致临床耐药的同时导致孔蛋白产量减少或碳青霉烯酶产量增加，从而发生细菌耐药。

1.5 生物膜的形成

细菌生物膜(Bacterial biofilm, BF)对抗菌药物和免疫反应具有较强的耐药性，是黏附在生物或者非生物表面的微生物群落，包括蛋白质、细胞外DNA和胞外多糖，为细菌提供了一种保护性的生活方式[31]。BF生成早期，表面黏附会诱导细菌基因表达的变化，产生特定的BF，从而增加BF的耐药性，之后BF基质中的胞外多糖成分可以削弱抗菌药物的渗透力，并对宿主免疫细胞的吞噬作用提供屏障，阻止抗生素进入，使它们对抗生素和宿主的先天免疫成分更具抵抗力，造成抗生素出现药物失效情况[20]。生物膜相关蛋白存在于CRAB胞外基质中，是CRAB生物膜形成过程中的关键蛋白。

2 CRO感染的抗菌药物

CRO感染在世界范围内普遍存在且耐药谱覆盖面广，对于所有的β-内酰胺类抗菌药物存在明显的耐药性，为临床医学疾病治疗带来了很大的难度。由于每一种新的药物都有自己的优点和注意事项，抗菌药物的合理使用发挥至关重要的作用。当前，国内外医疗对于CRO的疾病治疗药物通常有多黏菌素、替加环素、磷霉素或头孢他啶/阿维巴坦[32]等。由于抗菌药物之间可能存在协同效应，在治疗药物的选择上，联合用药被推荐使用。

2.1 多黏菌素

多黏菌素是一种碱性多肽类抗生素，主要分为A、B、C、D、E5种，目前我国常用多黏菌素B(Polymyxins B, PMB)及多黏菌素E(Polymyxins E,PME)。多黏菌素可以与革兰阴性杆菌外膜脂质A相互作用，导致细胞内容物外泄和细菌细胞死亡。对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠杆菌目细菌(除了黏质沙雷菌、变形杆菌、普罗维登菌、摩根菌和哈夫菌)和一些嗜麦芽假单胞菌具有活性[33]。多黏菌素具有显著毒性(肾毒性和神经毒性)，限制了其在临床的应用[34]，多黏菌素对CRO有较强的抗菌活性，但存在异质性耐药现象，不建议单独使用，根据病原菌的不同、感染部位的不同及测得的药敏情况，当需要使用黏菌素或多黏菌素B时，将其与至少1种其他不同类别的药物进行联合使用。

Zusman等[35]所完成的一项回顾性研究，对188例患者的死亡率进行了评估，多黏菌素单一疗法与多黏菌素与碳青霉烯类抗生素联合治疗比较，其死亡率和病死率显著低于单药治疗，因此支持联合用药。Samal等[36]研究报道，研究中有4863例患者被纳入分析，体外研究表明，碳青霉烯类和多黏菌素之间存在协同作用，主要见于不动杆菌属，克雷伯菌属和假单胞菌属，有高达50%的菌株显示协同作用。黏菌素/多黏菌素B联合使用的最常见的药物是替加环素，因此对于CRO感染患者，推荐使用最佳剂量的多黏菌素联合一种体外活性药物，病情严重时，可联合两种活性药物。

2.2 替加环素

替加环素是甘草环素类抗菌药，是米诺环素的半合成衍生物。它与细菌核糖体结合，具有高度亲和力，不受细菌对四环素类耐药的典型机制的影响[37]。在CRO中，替加环素对大多数CRE、CRAB、CRKP都有活性，Chang等[38]报道，替加环素在治疗严重感染方面并不比标准抗菌药物更有效，且有试验显示，其具有一定的副作用，增加了患者死亡率的风险。此外，替加环素一般不推荐用于菌血症，因为它具有抑菌活性，在当前推荐剂量下，血清中稳态浓度较低[37]。由于治疗CRO感染的有效药物稀缺，在没有全面客观评价的临床用药情况下，不能轻易地放弃替加环素，与黏菌素一样，替加环素在治疗对CRO感染时主要用于联合用药。易感菌谱的扩大、协同作用的潜力和耐药发生率的降低是使用联合治疗的主要理由。Bartoletti等[39]研究发现替加环素联合治疗的30 d死亡率明显低于单一治疗，三联用替加环素组的30 d死亡率明显低于双联用替加环素组。这些结果表明，替加环素联合治疗CRE感染比单一治疗更有效。

2.3 磷霉素

磷霉素是最早发现于1969年西班牙的老药，其主要作为一种口服制剂，主要用于治疗大肠埃希菌和粪肠球菌引起的尿路感染[40]。部分国家常使用静脉注射磷霉素，用于治疗各种革兰阳性菌和革兰阴性菌感染患者及多重耐药菌患者，如肺炎[41]。然而，单独使用磷霉素容易导致耐药菌株的出现[42]。因此，磷霉素在临床上经常与其他抗生素联合使用，以减少耐药突变的出现。

2.4 头孢他啶/阿维巴坦

阿维巴坦是一种二氮杂环辛烷(DBO)β-内酰胺酶抑制剂，2015年被批准与头孢他啶联合用于治疗复杂腹内感染(CIAIs)和复杂尿路感染(cUTIs)，随后2018年起用于治疗医院获得性和呼吸机相关性细菌性肺炎(HABP/VABP)[43]。头孢他啶/阿维巴坦复方制剂是可以对抗ESBL和碳青霉烯酶引起的细菌耐药性，阿维巴坦抑制Ambler A类KPC碳青霉烯酶和C类β-内酰胺酶以及D类部分苯唑西林酶(如Oxa-48碳青霉烯酶)[44]然而B类碳青霉烯酶(VIM、NDM)其不被阿维巴坦所抑制。Doi[45]报道，由于KPC基因的突变，10%的患者可能在使用该药物治疗时出现对头孢他啶/阿维巴坦耐药的KPC-肺炎。这些变异的KPC β-内酰胺酶不再能够有效地水解碳青霉烯类化合物，但对碳青霉烯类化合物的敏感性，但这一观察的临床意义尚待明确[46]。有研究显示头孢他啶/阿维巴坦对一些CRPA菌株也有效[47]，铜绿假单胞菌对头孢他啶/阿维巴坦的敏感性取决于影响外膜孔蛋白的改变、外排泵表达及β-内酰胺酶表达等多种耐药机制的共存。但头孢他啶/阿维巴坦对鲍曼不动杆菌或嗜麦芽杆菌无抗菌作用[48]。与黏菌素相比，头孢他啶/阿维巴坦的高成本可能是其受限使用的主要原因。Onorato等[49]报道，头孢他啶/阿维巴坦与老抗生素比较，它具有使用效果好、毒性更小的优势，但面临价格昂贵的挑战。

2.5 亚胺培南/西司他丁或瑞来巴坦

亚胺培南/西司他丁或瑞来巴坦是一种新型的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合，可增强微生物活性，对抗多重耐药革兰阴性病原菌包括耐碳青霉烯类非摩根菌科肠杆菌目(CR-NME)和难治性耐药铜绿假单胞菌(DTR-PA)[50]。瑞来巴坦是一种二氮杂双环辛烷抑制剂，没有直接的抗菌活性，但对Ambler A类和C类酶具有抑制作用[51]。亚胺培南联合瑞来巴坦可恢复其对大量CR-NME和DTR-PA的体外活性，但对鲍曼不动杆菌或产MBLs的革兰阴性菌(如NDM、IMP、VIM)、表达SME碳青霉烯酶的黏质沙雷菌没有活性[52]。在美国和欧洲联盟，没有其他代替治疗的情况下，该药被批准用于成人院内获得性肺炎、皮肤炎和其他耐药病原体(主要是CRE和CRPA)引起的感染[50]。

2.6 头孢洛扎/他唑巴坦(C/T)

头孢洛扎/他唑巴坦(C/T)是美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局批准的第五代头孢菌素/β-内酰胺酶抑制剂组合[53]，C/T联合治疗对铜绿假单胞菌(包括耐碳青霉烯和耐多药菌株)有强效抗菌作用，对肠杆菌目也有活性。C/T对不携带碳青霉烯酶的肠杆菌目分离株有超过75%的活性[54]。C/T联合用药治疗铜绿假单胞菌感染的毒性低于多黏菌素或氨基糖苷类药物[54]。Kanj等[56]发现，C/T 联合甲硝唑对产ESBL肠杆菌目患者的临床治愈率分别为95.8%和88.5%，与美罗培南具有非劣效性。

3 总结

CRO的耐药机制是复杂的，其产碳青霉烯酶是最主要原因，通道蛋白的缺失、外排泵的过度表达和生物膜的形成等也是细菌耐药性逐渐上升的重要原因，上述耐药机制可能是单独发挥作用也可能联合发挥作用。针对特定的耐药机制研发出新的抗菌药物，这对于解决抗菌药物耐药性问题具有重要意义。CRO已成为21世纪的主要医疗负担，为减缓碳青霉烯类抗生素耐药性的产生必须采取预防措施，临床医生必须要提高药物安全意识，合理使用抗菌药物，以尽量延缓碳青霉烯类抗生素耐药性的发展。