昆虫冷驯化及机制研究进展

梁馨亓，唐思琼，苏杰,2，张建萍

（1石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆石河子 832003；2棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000）

0 引言

昆虫作为一种变温动物，对季节的适应能力决定其生存状况，尤其以冬季的低温影响显著。低温冷驯化技术可以帮助昆虫度过冷胁迫环境，提高耐寒能力。根据驯化时间的长短，将冷驯化过程分为“快速冷驯化(rapid cold hardening，RCH)”和“长时冷驯化(cold acclimation，ACC)”。前者是指在数小时甚至数分钟内，将昆虫暴露于亚致死温度下，进行低温锻炼，来提高其对瞬时低温胁迫的抵御能力[1]；后者指经数周甚至数月的冷驯化，增强其低温耐受性，能让昆虫存活于随后的漫长寒冬[2]。快速冷驯化具有其临界诱导值，即一定程度的低温且持续一段时间，才能起到冷驯化效果，而超过适当的强度反而会使昆虫耐寒能力下降[3]。长时冷驯化处理温度相对温和，通常利用逐渐降低的温度和变化的光周期等环境刺激，使昆虫保持机体平衡，死亡率较低，长时冷驯化同时也与昆虫的越冬息息相关[4]。

目前，冷驯化技术一方面能显著延长天敌昆虫的货架期和提高天敌的寄生率或取食量，为生物防治提供保证，另一方面也为害虫防治提供思路。玉米螟赤眼蜂Trichogrammaostriniae可寄生亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis的卵，其经15℃驯化10 d 可长期储存[5]；丽蚜小蜂Encarsiaformosa作为烟粉虱Bemisia tabaci和温室白粉虱Trialeurodesvaporariorum的重要天敌，12℃驯化7 d 可以显著提高其寄生率[6]；花绒寄甲Dastarcushelophoroides成虫经4℃冷驯化0.5 h 时最易提高其耐寒性，为中国寒冷地区利用其防治光肩星天牛Anoplophoraglabripennis提供基础[7]。经冷驯化后适应较低温度的二星瓢虫Adaliabipunctata比未经处理的其他瓢虫取食更多的麦长管蚜Sitobion avenae[8]。南极摇蚊Belgicaantarctica幼虫经快速冷驯化处理后，再冷冻，相比于对照组存活率显著提高[9]。东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis的若虫经快速冷驯化后，冷休克恢复时间大幅减少[10]。

昆虫的冷驯化温度一般控制0℃至发育起点温度范围内，但超过某一限度，则会对天敌昆虫带来冷伤害。低温驯化是资源昆虫及药用昆虫保存的重要方法，同时通过低温驯化了解害虫的冷适应机制，可为治理虫害提供思路[11]。

1 冷驯化效果评估的生物学指标

1.1 过冷却点

昆虫的过冷却点(supercooling point，SCP)相关研究，最早在18 世纪30 年代，由Bachmetjew 第一次发现[12]，是昆虫冷驯化效果评估最主要、最直接的指标。昆虫的过冷却点越低，其耐寒能力越强，即冷驯化效果越好。根据过冷却点，可将昆虫的耐寒策略分为2种，一种是可以忍受胞外结冰的耐结冰型(freezing tolerant)，另一种是通过降低过冷却点来适应低温胁迫的不耐结冰型(freezing susceptible)。根据最新耐寒性分类方法，除了以上2 种类型外，还有冷敏感型(chillsusceptible)，它与过冷却点和是否结冰无关，而是在温度低于体液熔点(melting pointing)时死亡[2,13]。

DITRICH 等[14]对始红蝽Pyrrhocorisapterus种群的品系开展耐寒性测试，以SCP 作为其耐寒性的指标；赵静等[15]研究异色瓢虫Harmoniaaxyridis耐寒力，统计了生活于18℃下的成虫SCP约为-8～-6℃，生活于25℃的成虫SCP 约为-10～-9℃。但曹凯丽等[16]研究发现始红蝽在3 月时过冷却点最低可达(14.47±0.76)℃，但若将其置于-10℃时，其存活率仅为28.89%±12.81%，因此不能将过冷却点作为昆虫冷驯化效果评估的唯一指标。

1.2 其他指标

低温耐受能力的衡量指标除过冷却点(SCP)外，冷昏迷开始时间、冷昏迷恢复时间、致死下限等也是重要指标[13]。在一些研究中，不同学者会根据试验具体情况，确定昆虫冷驯化效果评估的指标。如评估对Gryllusveletis经-2℃下72 h 驯化后效果时，采用冷昏迷恢复时间作为指标，结果表明其从(16.8±4.9)min 降至(5.2±2.0)min[17]；也有一些学者采用半致死温度(lethal temperature of 50%，LT50)作为衡量指标，如关于始红蝽自然种群冷驯化试验中，普通条件下半致死温度最低为-8.53℃，0℃驯化后降至-9.21℃[16]；还有一些学者采用冰点(freezing point，FP)作为评估指标，结果显示Solenopsisjaponica经快速冷驯化后的冰点从-11.3℃降低至-15.3℃[18]。

2 影响昆虫冷驯化效果的因素

2.1 生物因素

2.1.1 昆虫生长发育情况一般昆虫的越冬虫态低温耐受能力较强，生长发育期的虫态耐寒力低。锈赤扁谷盗Cryptolestesferrugineus未经驯化和驯化后的SCP，卵分别为(-25.4±0.5)℃和(-25.1±0.2)℃；低龄幼虫分别为(-23.4±0.4)℃和(-25.5±0.5)℃；末龄幼虫分别为(-22.4±0.4)℃和(-22.2±0.4)℃；蛹分别为(-24.6±0.3)℃和(-25.1±0.4)℃；成虫分别为(-21.4±0.5)℃和(-23.7±0.4)℃[19]，因此针对锈赤扁谷盗的冷驯化，对低龄幼虫和成虫的驯化更有效。甜菜夜蛾Spodopteraexigua蛹耐寒性最强，其后依次为幼虫、成虫，卵的耐寒性最低[20]。同一虫态的不同发育阶段也存在差异。东亚飞蝗的卵在经30℃降温至-10℃（速度为0.05℃/min）的冷驯化处理后，再置于低温环境中（-10℃暴露10 h），发现发育中期和后期的卵存活率更高[21]。

2.1.2 滞育滞育是昆虫为抵御不良环境，如高温、低温、干旱等，而形成的一种适应机制。滞育对冷驯化效果具有促进作用，因此利用好冷驯化和滞育的交互作用，昆虫耐寒力可以得到显著提高。10L:14D 光周期诱导甘薯小象甲Cylasformicarius的生殖滞育显著提高了其成虫的耐寒性[22]。Lepidosaphesmalicola卵的最高孵化水平（孵化率为80%），即最高耐寒性，出现在滞育结束时（3月）冷驯化的卵中[23]。

2.2 非生物因素

2.2.1 温度不同的驯化温度和驯化时间显著影响冷驯化效果，1.2 中已有论述。需补充的是，若在昆虫进行冷驯化时对其进行高温间断，即变温(fluctuating thermal regime，FTR)，比长久暴露于恒定的低温(constant low temperature，CLT)下，存活率明显提高，这是由于间断性的高温可以修复冷胁迫带来的损害。异色瓢虫经相同时间低温暴露，成虫的存活率从高到低依次为：18℃变温处理、25℃变温处理、18℃恒温处理、25℃恒温处理[15]。同时，驯化温度与驯化时间也存在交互作用，当对玉米螟赤眼蜂15℃驯化10 d后冷藏保存，出蜂卵数达峰值为66.75±3.50，出蜂率为64.91%±2.04%；10℃驯化20 d 后冷藏保存，出蜂卵数为56.75±4.84，出蜂率达峰值为75.50%±6.7%[5]。

2.2.2 光周期光周期反应昼夜与季节变化，主要影响滞育的过程。昆虫为了保证种群繁衍及适应环境，需随着光周期的变化表现出相应的抗寒性。主要包括短日照滞育型、长日照滞育型、长日照-短日照滞育型和中间滞育型。

温度和光周期的交互作用会影响昆虫的耐寒性，一般情况下，短光照和低温有利于提高低温冷驯化的效果。如孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemusmontrouzieri，18℃和8L:16D 光周期或25℃和16L:8D 光周期使驯化的瓢虫发育至成年，随后在10℃和12L:12D 光周期下保持7 d，其过冷却点分别为-17.4℃和-16.8℃，比对照瓢虫的过冷却点-9.9℃显著降低[24]；MANENTI 等[25]通过每天减少光周期，即模拟冬季条件，增强了果蝇4个种Drosophilamelanogaster、D.simulans、D.mercatorum、D.virilis的冷驯化的效果。因此在对昆虫开展冷驯化时，短光照处理应成为较优选择。

2.2.3 其他因素目前关于湿度对昆虫冷驯化效果的影响报道较少，但湿度仍是重要因素。昆虫生活在自然环境中，其体内的水分，一方面来自食物，另一方面通过呼吸、体表渗透等方式从外界环境中获取。过冷却点是冷驯化效果评估最主要、最直接的指标。有研究表明，当温度在-20℃时，处于湿地的稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus不耐寒，死亡率达到100%，而处于干燥环境的死亡率只有35%[26]；在相同温度处理下，相对湿度30%的环境下二化螟Chilosuppressalis的过冷却点低于相对湿度50%的环境[27]，即冷驯化效果更好。

饲料等食源对其冷驯化效果也存在影响，过于充足的食源会大大降低冷驯化的效果。仓蛾圆柄姬蜂Venturiacanescens在摄食10%蜂蜜液后耐寒力显著下降，SCP约为(-15.2±0.2)℃，冷驯化效果较差；而未摄食处理组其SCP为(-21.7±0.6)℃(P＜0.01)，这是因为食物颗粒可以促进冰核的产生，在相对较高的温度时促进昆虫体液结冰使其死亡[28]。另有未摄食的雌性麦蛾柔茧蜂Habrobraconhebetor，其SCP 比已摄食雌蜂的SCP降低了约8℃[29]，即冷驯化效果更好。

综合以上分析，影响冷驯化效果的生物因素包括昆虫发育阶段、性别、滞育、激素调控等，非生物因素包括驯化处理、光周期、湿度等。但目前对昆虫冷驯化的研究仍存在一定局限，单一因素或较少因素对昆虫冷驯化影响已得到研究，但昆虫作为自然种群，存在于自然环境中，其抗寒能力往往是多种因素综合作用的结果，因此针对以上各因素是否存在大范围的交互作用、及作用大小有待进一步深入探讨。

3 冷驯化对昆虫适合度研究

冷驯化对昆虫的影响分为2 种，一种是生物学层面，主要涉及存活情况、繁殖能力等，一种是生理及分子层面，体现在通过调节昆虫体内各生理生化物质含量与活性，提高其耐寒能力。

3.1 存活率及寿命

在一定范围内，昆虫的存活率及寿命随驯化温度的降低及驯化时间的延长而增加，如Solenopsis japonica经快速冷驯化后在10℃下的存活率提高了44%[18]；在4℃冷驯化5 d后相比于对照组，冷驯化能显著提高二化螟绒茧蜂Cotesiachilonis的低温存活率[30]。快速冷驯化（0℃驯化处理3 h）使飞蝗Locusta migratoria在冷胁迫下的存活率从对照组的36%提高到74%[31]。适度的低温驯化（12℃驯化7 d）可以显著提高丽蚜小蜂Encarsiaformosa成虫在低温下的寿命[6]；黑腹果蝇Drosophilamelanogaster在3℃分别冷驯化1、2、3 h，随着时间的延长，寿命逐渐降低[32]。

3.2 生殖力及对后代的影响

冷驯化对昆虫生殖能力、后代的发育和性别所带来的影响，均存在物种差异性。如在4℃下驯化2 h会降低黑腹果蝇雄性的交配效率，表现为求偶时间的延长和交配率的下降[33]；而柑橘木虱Diaphorinacitri的优势天敌亮腹釉小蜂Tamarixiaradiata随着驯化温度的升高(2℃、4℃、6℃、8℃、10℃)，其繁殖力升高，而随贮藏时间的延长(3 d、6 d、9 d、12 d)，其繁殖力降低[34]。12℃驯化7 d 可以显著提高丽蚜小蜂成虫的羽化率[6]。但ZHENG等[35]冷驯化Leptocybeinvasa发现，冷驯化不影响后代性比及雌虫的生殖力。

3.3 其他影响

除以上影响外，冷驯化对昆虫体型、行为等也产生影响。异色瓢虫在低温18℃下的成虫体型比25℃下明显增大，但体型与耐寒能力呈负相关，这可能是由于体型增加，可以形成较大的冰晶，从而使耐寒力降低[15]。在10℃驯化6 d后，雌、雄亮腹釉小蜂后足胫骨的大小分别为320.28 μm 和279.63 μm，比对照组明显偏大[34]。冷驯化提高了黑腹果蝇的飞行高度，但使其飞行性能下降，此影响依赖于冷暴露的强度，且会在冷胁迫消失后持续很长时间[36]。这对研究昆虫种群的生态学和进化反应具有一定的指导意义。

4 昆虫冷驯化的机制

4.1 调节抗寒类蛋白活性

热激蛋白(heat shock protein, HSP)是一种在逆境胁迫中使变性蛋白重新折叠修复的保护性、应激性的分子伴侣，又称为“热休克蛋白”[37]。冷驯化使昆虫耐寒性提高的最明显的生理变化为热激蛋白的表达量升高。根据其分子量，可以分为多个家族，如HSP40、HSP70、HSPl00 和小分子HSP(sHSP)等。SONG 等[30]研究表明二化螟绒茧蜂的HSP40 和HSP90 具有相似的表达模式，在-12℃低温暴露时均显著上调，HSP70可被高温和低温诱导表达；CUI 等[31]测试了飞蝗Locustamigratoria快速冷驯化处理后HSP20.5，HSP20.6，HSP20.7，HSP40，HSP70 和HSP90 的表达量，发现除HSP90 外，其余热激蛋白基因在转录组水平上的表达量均显著上调；三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii经-20、17.5、-15、-12.5、-10、-7.5℃低温驯化后，HSP20、HSP40、HSP70 和HSP90 均响应冷驯化，表达量显著上调[38]。

抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是生物为适应极端寒冷的环境，体内产生的一种改变冰晶生长和抑制冰晶重结晶的蛋白质，可以降低昆虫血淋巴或体液的冰点，且因其具有热滞活性(thermal hysteresis activity, THA)，又称“热滞蛋白”(thermal hysteresis proteins，THPs)[37]。有研究将黄粉虫Tenebriomolitor初龄幼虫(11～13 mg)暴露于4℃下4周引起热滞蛋白浓度增加约20 倍，将末龄幼虫(100～120 mg)暴露于低温条件导致热滞蛋白表达增加12倍[11]。

抗寒性蛋白除了热激蛋白、抗冻蛋白外，靶基因研究显示还有其他的基因与冷适应相关。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一种促进水移动穿过细胞膜的通道，被认为是耐结冰型昆虫的关键性蛋白[39]。它对水在细胞内外的快速移动十分重要，当结冰时，它们能够调节细胞体积以及渗透情况。Eurostasolidaginis在秋冬季时体内的水通道蛋白含量升高，证明了水通道蛋白在提高耐寒性上具有一定的作用[40-41]。

4.2 代谢调节在昆虫耐寒性中的作用

4.2.1 离子代谢调节在冷驯化中，维持细胞渗透平衡和离子稳态对昆虫的功能运行至关重要。Ca2+、K+、Na+等无机离子在溶质跨膜过程中发挥重要作用，可以调节机体因低温胁迫引起的有毒代谢产物的积累，维持正常的新陈代谢，但其在不同昆虫中的作用与代谢变化不完全一致[39]。

快速冷驯化过程中通常伴随着细胞内Ca2+浓度的增加，东亚飞蝗Ca2+内流可以诱导快速冷驯化，也起到减少冻伤的作用[42]，因此细胞可能通过Ca2+来感知温度并调整细胞的生理状态；将黑腹果蝇暴露于冷胁迫时，体内K+浓度平衡逐渐被破坏，冷驯化使低温下K+重吸收相对减少，促进低温下离子和水稳态的维持[43]；黑腹果蝇在低温下失去了调节Na+平衡的能力，耐冷果蝇的血淋巴Na+浓度较低，使它们能够维持血淋巴容量，防止高钾血症，避免冷胁迫带来的损伤[44]。

4.2.2 增强保护酶系统的活性在逆境条件下，昆虫体内的自由基含量增加，如单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)、超氧化物阴离子(O2-)等活性氧，对正常代谢造成损害，即氧化胁迫。其涉及到昆虫体内的抗氧化保护酶系，即超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)，它们可以清除自由基及活性氧。SOD能转化部分自由基为H2O2，POD、CAT 将H2O2转化为H2O 和O2，因此在SOD、POD、CAT 酶的共同作用下，可以使昆虫体内的自由基维持在一个低水平，减轻冷胁迫的损害，从而增强其耐寒力[15]。

对广聚萤叶甲Ophraellacommuna冷驯化处理，随着快速冷驯化强度的增加，CAT 和SOD 活性先增后减，而POD 酶活性则相反[3]；石榴螟Ectomyelois ceratoniae经冷驯化(-15℃、30 min)后，2 种抗氧化酶SOD和CAT的活性随着胁迫强度的增加而升高，这表明在冷胁迫中这些酶对昆虫起着保护作用[45]。美国白蛾Hyphantriacunea从8月至次年3月（秋冬季）SCP与SOD 酶活性呈显著负相关，即随着环境温度的降低，SCP 逐渐降低，SOD 表达活性增强，且关联性较强[46]。而在其他一些昆虫的滞育中，抗氧化防御机制却出现了下调现象，推测是因为滞育情况下的基础代谢速率下降导致虫体活性氧积累减少的原因[47]。

4.2.3 脂肪代谢调节脂肪作为昆虫三大营养物质之一，在昆虫的耐寒性上发挥重要作用，最主要的是提供能量，在减少昆虫体内自由水含量和游离脂肪影响过冷却点等方面也发挥作用。昆虫通过调节体内脂肪酸脱饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)的活性，提高不饱和脂肪酸的比例，以提高细胞膜的流动性。脂肪的代谢产物甘油，可以降低昆虫过冷却点，提高昆虫耐寒能力[48]。异色瓢虫成虫在较低发育温度(18℃)下，体内脂肪含量高于室温下(25℃)[15]；快速冷驯化加速了广聚萤叶甲成虫体内油脂的代谢，随着快速冷驯化强度的增加，成虫体内的甘油含量呈曲线变化，并于0℃驯化4 h达到最高值[16]；Orchesellacincta经冷适应后成虫细胞膜的不饱和脂肪酸组成比幼虫细胞膜的多，即膜脂在冷驯化过程中变得更加不饱和[49]。

由于短链脂肪酸的熔点低于长链脂肪酸，一些昆虫提高短链脂肪酸比例（如16C 脂肪酸相对于18C 脂肪酸的比例），来提高过冷却能力。如经低温驯化的Sarcophagasimilis显示出较高比例的棕榈酸（又称“软脂酸”）和油酸，其他脂肪酸（硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸）无显著变化[44]。

4.2.4 糖类及其类似物的代谢调节海藻糖(trehalose)是昆虫血淋巴中最重要的糖类物质，被称为昆虫的“血糖”。在逆境时可以被降解为葡萄糖，调节供能，帮助昆虫顺利度过逆境胁迫[50]。有研究表明赤拟谷盗Triboliumcastaneum在不同处理下的情况，低温驯化后的海藻糖和肌醇含量最高[51]；豆荚螟Marucavitrata经快速冷驯化使得血淋巴海藻糖浓度显著升高，且在快速冷驯化期间，海藻糖-6-磷酸合酶的表达水平显著上调[52]。

除了海藻糖，山梨醇、肌醇、果糖等在昆虫耐寒性上也发挥重要作用。这些小分子物质能够增强细胞膜和蛋白质的稳固性，防止细胞出现渗透伤害，提高昆虫的耐寒能力。有研究热带和温带飞蝗种群的卵中8种低分子量糖和多元醇在低温驯化(5、0、-5℃)下的积累模式，结果表明大多数糖和多元醇经-5℃驯化后表达量升高，热带种群低温处理显著积累果糖、葡萄糖、山梨醇和肌醇，温带种群的葡萄糖、甘露醇、山梨醇、肌醇显著积累[53]。

4.2.5 氨基酸代谢调节游离氨基酸在昆虫体内能起调节血淋巴的渗透压的作用，而昆虫的渗透压与过冷却点有显著相关性，即昆虫体内的游离氨基酸含量与耐寒性存在相关关系[54]。脯氨酸被认为是黑腹果蝇体内主要的低温保护剂，使果蝇从不耐结冰型变为耐结冰型[55]；长期的低温驯化使黑腹果蝇的脯氨酸含量显著升高[54]。

4.2.6 激素调控体内激素环境变化影响昆虫滞育，同样也影响人为冷驯化的效果。具体表现为内分泌系统在接收上游信号后，会改变各内源激素分泌量来传递相关信息，以调控下游信号通路[56]。滞育激素种类包括保幼激素(juvenile hormone，JH)、蜕皮激素(ecdysone)、胰岛素(insulin，RI)、脂动激素(adipokinetic hormone，AKH)等。如保幼激素主要作用于昆虫的发育和生殖，幼虫期可阻止昆虫化蛹，成虫期调控雌虫发育成熟，影响生殖滞育，从而影响冷驯化的效果[57]。蜕皮激素参与昆虫的蜕皮与翅芽的生长，也调控昆虫能量代谢，这在昆虫滞育的解除中发挥重要作用[58]。胰岛素是调节昆虫体内糖、脂肪和蛋白代谢的作用，影响昆虫生长发育，还能够参与果蝇等一些昆虫的滞育诱导调控[59]。滞育激素通过调节昆虫滞育活动，调控下游信号，间接地影响冷驯化效果。

综合以上代谢调节分析，发现昆虫冷驯化涉及多方面的调节，如在宽翅曲背蝗Pararcypteramicroptera meridionalis卵低温驯化过程中过冷却点、含水量、葡萄糖浓度降低，脂肪、海藻糖、甘油、肌醇、山梨醇含量升高；检测的低分子糖和多元醇中，海藻糖浓度最高，其次是甘油；脯氨酸和谷氨酰胺分别增加了46.3%和13.2%，且与过冷却点呈负相关[60]。虽然已有少数研究明确了冷驯化时昆虫不同的生理及分子机制反应，但其交互影响及内在联系有待进一步发掘。

5 总结与展望

冷驯化是提高昆虫耐寒性的关键技术之一，学者们广泛使用长时冷驯化和快速冷驯化的方法对其开展研究，明确影响冷驯化效果的因素、冷驯化对昆虫的适合度，探究了冷驯化机制，但仍存在一些问题。第一，相比于长时冷驯化的研究，快速冷驯化相关研究较多，但昆虫越冬往往采取与长时冷驯化相似的方式来调节自身耐寒性，因此可以在诱导快速冷驯化时延长降温时间，以尽可能模拟自然环境的降温。第二，低温处理期间的高温间断，是提高驯化效果的有效手段，目前相关研究较少，但这种方法可以一定程度上减轻持续低温对昆虫带来的损害，也为实践应用中的昆虫保存提供参考。第三，对于冷驯化的生物学影响和生理机制的研究，各因子的交互作用及内在联系亟待进一步探索。第四，冷驯化技术的机制研究上仍有许多发展空间，如对快速冷驯化，仅发现了一些重要的上游因子如Ca2+浓度，而下游调控过程较为模糊。

昆虫冷驯化技术有利于使用天敌昆虫进行生物防治，推动建设绿色中国，同时通过冷驯化技术，可以分析农林害虫的越冬情况及耐寒能力，为科学防治提供依据，还可以为一些资源昆虫、药用昆虫的保存提供参考，具有良好发展前景。