免疫层析技术在兽医检测领域的应用

朱向东，朱雅宁，刘 伟，赵 静，赵玉锰

（天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402）

免疫层析技术是上世纪70 年代出现的一种血清学检测技术，以抗原-抗体特异性的免疫学反应和层析技术为技术基础，利用毛细管床的虹吸作用和示踪颗粒显色反应，大约5～15 min 可直观地观察到检测结果，具有操作简便、检测快速、成本低廉等优点，适合临床快速检测应用。

免疫层析技术包括双抗夹心法和竞争法两种。双抗夹心法是在信号发生区发生抗原夹心免疫反应，当检测线和质控线均显色时判定为阳性结果，若检测线不显色而质控线显色时判定为阴性结果。竞争法则正好相反，当检测线和质控线均显色时判定为阴性，而只有质控线显色时判定为阳性。根据标记物不同，目前主要包括胶体金、荧光免疫层析、纳米酶和液相芯片等四种免疫层析试纸条检测技术。

1 胶体金免疫层析试纸条检测技术

1971 年Faulk 和Taytor 将胶体金引入免疫化学后，胶体金免疫层析技术快速发展并在兽医检测领域得到了广泛的应用。2004 年姜建宏用原核表达制备伪狂犬病病毒gE 蛋白抗原和全病毒抗原研制了区分野毒感染和疫苗免疫的鉴别胶体金免疫层析法。2007 年王慧杰等建立了检测猪圆环病毒Cap蛋白抗体的胶体金检测方法，具有较强的灵敏性和稳定性。2008 年蒋韬等建立了O 型口蹄疫病毒免疫层析试纸条检测方法，其灵敏性高于反向间接血凝试验。2014 年张鑫宇等建立了非洲猪瘟病毒p54 抗体的胶体金检测试纸条，敏感性可达到200 ng/mL，适合非洲猪瘟病毒感染早期检测使用。2020 年王海丽等建立了羊布鲁氏菌的胶体金检测方法，具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点，适合于羊布鲁氏菌病抗体的现场检测。2021 年李昕等利用双抗体夹心法将口蹄疫病毒的兔抗及豚鼠抗体作为标记胶体金，分别制备出检测O、A、Asia 1 血清型的3种层析试纸卡，对O、A、Asia 1 型病毒的最低检出量分别为0.567、0.693、0.219μg/mL，从而建立了口蹄疫病毒抗原血清型的快速分型和定量的检测方法。2023 年余春明等建立了犬瘟热、犬细小病毒胶体金二联检测卡，该方法特异性强，灵敏度好，可用于临床快速诊断。

2 荧光免疫层析试纸条检测技术

2.1 荧光微球免疫层析试纸条检测技术 荧光微球进行标记时是通过共价结合的方式，提高了免疫探针的稳定性，与传统的胶体金免疫层析试纸条相比，具有独特的优势。2014 年杨亚杰等建立了定量检测牛乳中酪蛋白荧光微球免疫层析法，可快速、方便、高效的检测牛乳制品中的过敏原（酪蛋白）。2016 年裴星瑶等建立了快速检测鸡饲料中喹乙醇含量的荧光微球免疫层析法，大大提高了灵敏度。2022 年邵颖等建立了血清4 型禽腺病毒POCT 荧光微球免疫层析检测方法，该方法可以在15 min内检测出结果，与临床诊断结果相符，可以用于基层兽医临床检测。2022 年杨艳利用禽白血病病毒P27 蛋白多克隆抗体制备了荧光微球免疫层析检测技术，为禽白血病的种群净化和禽白血病的检测提供了简便的方法。2023 年王英超等研制了一种快速检测牛布鲁氏菌抗体的荧光快速检测试纸卡，该方法与荧光偏振方法的符合率为100%，可以适用于临床样品的快速检测。

2.2 量子点免疫层析试纸条检测技术 量子点与传统的有机染料相比，具有明显优势，已成为一种非常有潜力的荧光探针标记物。2020 年，孔玉方等以量子点荧光微球作为示踪物，共价偶联布鲁氏菌外膜蛋白OMP22，并将布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22 的单克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，组装制备了检测速度快、灵敏度高、特异性强且成本低的量子点荧光微球免疫层析试纸条，可用于布鲁氏菌病的现场筛查。2022 年史伯昌等建立了量子点荧光微球布鲁菌病快速诊断方法，对临床血样的总敏感性为97%，特异性为90%，可以用于基层布鲁氏菌病的净化检测。2023 年徐志远等根据非洲猪瘟病毒VP72 蛋白的氨基酸序列建立了非洲猪瘟病毒荧光量子点检测试纸条，与商品化的非洲猪瘟荧光定量PCR 检测试剂盒阳性符合率为82.1%（23/28），阴性符合率为93.8%（75/80），可以用于非洲猪瘟病毒的现场快速诊断。

2.3 上转换发光免疫层析试纸条检测技术 2018年洪霞等以上转换发光材料（UCP）为新型标记物，采用竞争免疫反应建立了快速检测黄曲霉毒素B1的上转换发光免疫层析检测卡方法，并对试纸条性能进行评价。2019 年黄震等制备了上转换纳米材料（Upconversion Nanoparticles,UCNPs）,并将其应用于免疫层析平台，从而建立了一种检测牛奶中大肠杆菌O157:H7 方法的上转换免疫层析方法，该方法灵敏度较高，抗基质干扰能力强，不仅能用于大肠杆菌O157:H7 的检测，也可被推广应用于其它食源性致病菌检测。2022 年张运莲建立了牛奶中抗生素残留（卡那霉素、四环素和氨苄青霉素）的上转换荧光纳米传感检测方法，为牛奶中抗生素的痕量检测提供了新思路。

2.4 时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术 时间分辨荧光免疫层析技术是用稀土元素（Eu、Tb、Sm等）作为标记物，其检测灵敏度比胶体金试纸条等高出2～3 个数量级。2020 年王华俊等采用单克隆抗体技术和荧光微球免疫层析技术，制备PRV gE 抗原的时间分辨荧光微球免疫层析试纸卡，该试纸卡可在15 min 内定量检测样品中PRV gE 抗原，与PRV gE 与gD 二重实时荧光PCR 的总符合率为89.55%，可以用于PRV 抗原的定性检测，具有良好的临床应用价值。同年，朱玲等建立了可定量检测猪血清或乳汁中PEDV IgG 或IgA 抗体的时间分辨荧光免疫层析试纸条，具有灵敏、特异、准确、操作简便、检测快速的特点，符合临床快速检测的要求，可用于临床上PEDV IgG 和IgA 的快速检测。2021 年王华俊等建立了猪流行性腹泻病毒时间分辨荧光免疫层析检测方法，最佳检测时间15 min，可以用于PEDV 的现场检测。2022 年孔繁霞等研制了基于时间分辨荧光微球的黄曲霉毒素B1 定量检测卡，具有灵敏度高、重复性好的优点。

3 纳米酶免疫层析试纸条检测技术

纳米酶免疫层析试纸条检测技术是以纳米酶为标记物的又一新型检测方法。该方法有效解决了传统胶体金免疫层析试纸条检测技术灵敏度低的问题。2016 年何晖等建立了一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免疫层析方法，具有良好的特异性和灵敏性，适用于现场快速检测。2020 年刘键等研制了纳米酶免疫层析试纸条，该试纸条对诺如病毒的最低检出浓度为10 ng/mL,比普通胶体金试纸条灵敏度高10 倍；与轮状病毒、腺病毒、幽门螺杆菌均无交叉反应，具有简便、快速、可现场应用的优点,在诺如病毒快速检测中具有实际应用价值。

4 液相芯片

液相芯片（Liquid chip，LP）又称荧光微球免疫学检测技术（Fluorescent-microbead immunoassay，FMIA），是一种结合荧光微球作为抗原复合物结合抗体的蛋白质检测方法。该方法可以在同一样品中对多种分子同时进行定性或定量分析，不仅可以进行高通量检测，而且大大提高了样品利用率。2018年曾梦利用原核表达载体pMAL-c5x 对猪伪狂犬病毒gE 和gB 蛋白进行了可溶性表达，以制备的重组蛋白为抗原与微球偶联，分别建立 gE、gB IgG抗体单一FMIA 检测方法，并在此基础上建立了gE、gB 的双重FMIA 检测方法，该方法优于同时建立的ELISA 方法，可以用于PRV 野毒感染和疫苗免疫猪IgG 的快速鉴别诊断及检测。2021 年曹丙蕾等建立了猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎二重液相芯片检测方法，可用于猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒的鉴别诊断，与荧光RT-PCR 检测方法的符合率为100%。2022 年王群等建立了牛病毒性腹泻病毒抗体液相芯片高效检测方法，灵敏度高于ELISA 方法，为牛病毒性腹泻病毒的口岸快速检测提供了一种新的方法。2023 年邬旭龙等建立了同时检测7 种猪繁殖障碍性疫病的方法，该方法能够同时检测猪伪狂犬病病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2 型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和非洲猪瘟病毒等7 种猪繁殖障碍性疫病，最低检测限度为103 copies/μL，为猪病多种病原快速鉴别诊断提供了技术储备。

5 展 望

胶体金免疫层析检测技术在兽医快检领域已经得到了广泛的应用，对动物疫病的快速诊断和早期诊断发挥了积极的作用。近年来，荧光微球免疫层析技术也已经在兽医领域进行了不断的研究和推广应用。可见，以后的免疫层析技术肯定朝着半定量、定量和高通量检测方向发展。此外，免疫层析检测技术结合互联网手段在动物疫病的监测和数据分析方面的发展和应用将为兽医领域的健康发展保驾护航。