谷胱甘肽还原酶影响结肠癌代谢及预后:一项基于蛋白组学与微阵列芯片分析的研究

吴 惧,常耀元,李子群,尹家俊,王禹尧

(大连大学附属中山医院 肝胆外科·大连市肿瘤生物医疗和基因检测重点实验室,辽宁 大连116001)

结直肠癌(CRC)是世界上最常见的三大癌症之一,在死亡率方面排名前两位,据统计2020年全球有1 931 590例新发病例和935 173例死亡病例[1-2]。近几年,随着医学诊疗技术的发展,肿瘤分子靶点和生物治疗逐渐成为临床治疗的有力手段[3]。在过去的几十年里,靶向癌症代谢受到了广泛关注,因为肿瘤代谢在肿瘤的发生发展中起着关键作用,包括葡萄糖代谢、核酸代谢、酶代谢、蛋白质代谢等[4]。GSR基因编码谷胱甘肽(GSH)还原酶,位于8p12,在氧化还原稳态和细胞抵抗氧化应激中起关键作用[5]。谷胱甘肽是一种主要的细胞内抗氧化剂,在维持细胞内氧化还原稳态、信号转导、异生物代谢和硫醇平衡方面起着至关重要的作用[6-7]。本研究旨在探讨GSR对结肠恶性肿瘤代谢、临床特征以及预后的影响,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集5例结肠癌患者病理标本(每例患者分别取结肠癌组织和对应的正常结肠上皮组织),对样本采用DIA(Data independent acquisition)质谱技术进行差异蛋白分析。收集120例结肠癌患者(60例结肠癌+60例结肠癌合并肝转移癌)原发灶病理标本用以制作组织微阵列芯片。所有患者术前未行新辅助化疗。本研究已获得大连大学附属中山医院伦理委员会批准,并获得所有患者或家属的知情同意。

1.2 生物信息分析

1.2.1蛋白组学分析 根据可信蛋白选择两个标准计算样本间差异。Foldchange(FC)用于评估样本间蛋白表达水平的倍数变化。采用t检验计算样本间差异的P值。差值过滤条件为|log2(FC)|=1且P<0.05。基于R语言对数据和样本进行无监督层次聚类。

1.2.2KEGG富集分析 获取DAVID数据库中的差异表达蛋白,对差异蛋白进行KEGG富集分析,描述其功能。

1.2.3蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)分析和相关性分析 使用String分析工具进行PPI分析,并使用CytoHubba插件筛选出连接节点数最多的前10个蛋白。使用Timer网络分析工具进行相关性分析。

1.2.4生存分析 使用网络分析工具GEPIA2进行生存分析。

1.2.5临床特征相关性分析 临床特征相关性分析采用UALCAN网络分析工具。

1.3 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色采用DAB免疫组织化学染色试剂盒(zgb-bio,#ZLI-9018)。用GSR抗体(SAB,#31078,稀释度:1∶100)孵育过夜,用苏木精复染。所有染色结果由本中心的专业病理医师观察和分析。

1.4 统计分析

数据采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。组间差异蛋白的比较采用Student’sT检验。相关性分析采用Spearman相关分析方法。Kaplan-Meier生存分析采用logrank检验。免疫组织化学染色结果采用ImageJ软件进行分析,P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 差异蛋白的筛选与KEGG通路分析

蛋白组学差异分析结果共获得1 536个差异蛋白,其中977个显著上调,559个显著下调(图1)。排除结肠癌组织和正常结肠上皮组织中未检测到的蛋白,共鉴定出1 209个差异表达蛋白(P<0.05)。

图1 差异蛋白筛选

对差异表达蛋白进行KEGG富集分析(图2),1 209个差异蛋白中有144个蛋白显著富集于代谢通路,结果具有统计学意义(P<0.05)。

图2 KEGG功能富集分析

2.2 PPI网络构建及关键蛋白的获取

通过Cytoscape软件进行蛋白-蛋白相互作用网络分析,CytoHubba插件统计节点之间的连接数,筛选出代谢通路富集的144个蛋白中连接节点数最多的前10个蛋白:ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ALDH18A1、ALDH3A1、GSTA1、GSTA2、HPGDS、GSR(图3)。通过Timer数据库进行相关性分析,发现部分蛋白之间相关性有统计学意义,见图4。

图3 PPI网络分析

2.3 关键蛋白的生存分析

使用GEPIA2数据库进行生存分析显示,GSR低表达降低了结肠癌患者总生存期(P=0.0 017,HR=0.45),而ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ALDH18A1、ALDH3A1、GSTA1、GSTA2、HPGDS不影响结肠癌患者总生存期(图5)。

图5 Kaplan-Meier生存分析

2.4 GSR与临床信息相关性分析

利用UALCAN数据库,分析GSR表达与结肠癌患者临床信息的相关性(图6)。与正常结肠上皮组织相比,GSR在结肠癌组织中的表达降低,其中GSR在Ⅰ期结肠癌中表达最高、在Ⅳ期结肠癌中表达最低,GSR在N1期和N2期的表达较N0期降低,发生TP53突变的结肠癌中GSR的表达下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图6 GSR对临床特征的影响

2.5 GSR免疫组织化学分析

使用组织微阵列芯片进行免疫组织化学染色(图7)。微阵列染色结果显示,正常结肠上皮组织(N)中GSR染色强度最高;合并肝转移的结肠癌组织(CRLM)中GSR染色强度最低;未合并肝转移的结肠癌组织(CRC)中GSR染色强度介于N和CRLM之间,3组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图7 微阵列芯片染色结果

3 讨论

结肠癌仍然是医学界的难题,也是癌症相关死亡的主要原因。随着肿瘤分子靶点和生物治疗的不断发展,特别是对肿瘤代谢认识的不断加深,为结肠癌的治疗提供了新的信心和方向[8-9]。2017年的一项研究发现,二氯乙酸通过减少糖酵解抑制结肠癌细胞的增殖,这项发现进一步凸显了代谢因素在结肠癌发展中的重要性[10]。本研究蛋白组学结果发现,在结肠癌的1 209个差异表达蛋白中,有144个显著富集于KEGG代谢通路,蛋白相互作用网络及相关性分析发现,ADH家族、ALDH家族、GSTA家族、GSR和HPGDS蛋白在代谢通路中发挥关键作用。这些结果支持了代谢因素在结肠癌中的重要作用。通过生存分析发现,GSR高表达的结肠癌患者较低表达的结肠癌患者预后更好。2019年的一项研究中,GSR缺陷型肺癌被确定为硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(TXNRD)抑制剂的可能靶点[11]。因此,GSR可能参与了结肠癌细胞代谢的重要步骤。

近年来,研究发现肿瘤细胞可以通过代谢影响免疫细胞的浸润,进而影响免疫治疗的疗效和耐药性。通过调控肿瘤的代谢,进而改变肿瘤的免疫微环境,为临床肿瘤患者的免疫治疗提供了新的思路与方向[12-19]。2020年MONSERRAT-MESQUIDA M 等[20]的一项关于代谢综合征(MetS)的研究发现,MetS以氧化应激为特征,会导致炎症、血管功能受损以及动脉粥样硬化,并观察到MetS人群中GSR的活性和蛋白水平较高,而体内的循环白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞较低。这可能是因为高抗氧化应激的防御能力使免疫细胞处于一种预激活状态,进而形成促炎状态,而肿瘤微环境中浸润炎症细胞的丰度与免疫检查点抑制剂(ICIs)的疗效密切相关,考虑GSR可以作为一种免疫刺激剂,促进结肠癌细胞的免疫浸润,进而提高临床免疫治疗的疗效。有研究证明,趋化因子参与了结肠癌发生发展的过程,从而导致癌细胞的迁移、黏附和趋化[21]。2019年的一项研究发现[22],长期接受阿霉素化疗的患者,体内GSR以及其他抗氧化应激因子水平升高,同时IL-6、IL-8以及CXCL-1水平下降。在结肠癌中,GSR水平的升高,可能会导致某些趋化因子的活性或水平降低,当GSR表达降低,对趋化因子的抑制作用被解除,进而导致结肠癌细胞的转移。本研究组织微阵列芯片免疫组化结果显示,GSR在合并肝转移的结肠癌组织中的表达显著低于未合并肝转移的结肠癌组织,这可能是因为GSR的下调导致趋化因子的活性与水平增加,进而促进了结肠癌肝转移的发生。生存分析显示,GSR在结肠癌中作为肿瘤抑制因子显著改善患者预后,同时发现,GSR与结肠癌患者的N分期、总分期和TP53突变相关,因此考虑GSR可能在结肠癌中作为一种抑癌因子发挥保护作用,当GSR表达下调,这种保护作用被破坏,进而促进恶性肿瘤的发生发展。其具体机制将在未来进一步设计实验来探索。

综上,GSR在结肠癌代谢通路中发挥关键作用,并且其表达可能影响结肠恶性肿瘤的代谢、肿瘤分期、TP53突变以及结肠癌患者预后。