芍药根茎形成发育过程中内源激素和碳水化合物的变化

王慧娟，王二强，符真珠，李艳敏，王晓晖，袁 欣，高 杰，王利民，张和臣

（1.河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002；2.洛阳市农林科学院，河南 洛阳 471023）

芍药（Paonia lactifloraPall.）是我国的传统名花，具有悠久的栽培历史，近年来更成为切花市场的热销种类。目前芍药切花市场几乎被国外品种占据，我国芍药新品种的培育则刚刚起步[1-2]。芍药是一种典型的多年生地下芽植物，其位于地下的根茎是连通芍药地上茎枝与地下肉质块根的“枢纽”[3]，是芍药植株能够自然更新、分株繁殖的前提和基础，研究根茎的初始发生、发育及其更新具有重要的理论和应用价值。地下芽植物的储藏器官通常位于地下，由根、叶、茎或下胚轴进化而来，根据形态学分为鳞茎、球茎、块茎、根茎和块根[4]。植物激素在储藏器官的形成和发育过程中发挥着重要作用。郁金香和百合的更新鳞茎中GA3/ABA 出现较高比值，表明内源激素的平衡是更新鳞茎发生和发育的调节因子[5-6]；唐菖蒲、番红花、香雪兰等球茎花卉球茎发育进程均与内源激素ABA、GA3、IAA水平以及激素之间的动态平衡密切相关[7-9]；马铃薯、菊芋等块茎的形成与GA3和ABA 关系最为密切，GA3抑制块茎形成，ABA 具有促进作用[10-12]；在多花黄精和滇重楼等根茎植物中也发现ABA 对新生根茎的形成和膨大具有促进作用[13-14]；甘薯、地黄等块根产量的形成和提高也是内源激素协调作用的结果，其中细胞分裂素类以及ABA、IAA、GA3等内源激素的作用最为突出[15-16]。淀粉和蔗糖等碳水化合物是储藏器官积累的主要物质，例如马铃薯块茎发育的物质基础是淀粉和蔗糖[17]；山葵根茎生长旺盛期可溶性糖含量较高，淀粉一直保持上升趋势[18]；百合芽到小球的转变过程中淀粉是基本的碳水化合物[19]；莲藕根茎的膨大是葡萄糖和淀粉的相对平衡导致的[20]。

关于芍药根茎的研究目前只涉及根茎解剖结构特征、根茎发育形态变化和更新规律以及根茎芽休眠越冬等方面[21-22]，对于芍药根茎的初始形成及发育过程中内源激素及碳水化合物的动态变化则未见相关报道。鉴于此，以芍药实生苗为试验材料，研究其根茎形成和膨大过程中ABA、赤霉素类、生长素类、细胞分裂素类等内源激素含量的动态变化，并结合淀粉、可溶性糖等碳水化合物含量的变化，解析芍药根茎形成和发育的生理机制，从而对芍药种苗的培育、生长调节以及进一步挖掘芍药根茎形成和发育的分子机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试芍药品种为杭白芍。于2021 年8 月采集完全成熟的种子，常温沙藏，待种子下胚轴长度大于1 cm 时于4 ℃沙藏35 d，然后种植于人工气候室。跟踪根茎发育，根据形态分别选取定植后30、60、75、90 d 的时间节点截取根茎，混合取样，每个时期设3 个生物学重复。液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

1.2 测定指标与方法

根茎直径：每个时期随机选取10 株实生苗，用游标卡尺量取根茎部位的最大直径，计算平均值。

激素含量：将芍药根茎用液氮研磨成粉末，用于赤霉素类检测的加入10 μL 100 ng/mL 的内标混合工作液，用500 μL 乙腈/水（90∶10，体积比）溶液涡旋15 min 进行提取，并在提取液中加入10 μL 三乙醇胺（TEA）和10 μL 3-溴丙基三甲基溴化铵（BPTAB），90 ℃反应1 h 后，氮气吹干，然后复溶、过滤；用于其他内源激素检测的加入100 ng/mL 的内标混合溶液及1 mL 提取剂[V（甲醇）∶V（水）∶V（甲酸）=15∶4∶1]，混匀、离心，提取上清液，然后复溶、过滤。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台，定量检测不同发育时期ABA 以及赤霉素类、生长素类、细胞分裂素类的含量。

碳水化合物含量：利用气相色谱-串联质谱（GC-MS）平台定量检测样品中葡萄糖、蔗糖、果糖等主要可溶性糖含量；采用蒽酮法测定淀粉含量。

1.3 数据分析

利用Excel和SPSS软件对测定结果进行统计分析。对内源激素含量数据进行UV（Unit variance scaling）处理，使用R程序脚本绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 不同发育时期芍药根茎形态和直径的变化

根据形态将芍药实生苗根茎的形成和发育划分为4 个时期（图1）：营养生长期（Ⅰ）、根茎转换期（Ⅱ）、膨大期（Ⅲ）、膨大后期（Ⅳ）。从图1 可以看出，随着根茎的发育，根茎直径呈逐渐上升的趋势。营养生长期，上胚轴萌芽生长，下胚轴形成根系，二者之间没有明显的根茎部位，上下胚轴结合部位的直径只有2.46 mm（定植后30 d）；根茎转换期，胚根上部开始膨大，地下根系和胚芽之间开始增粗，形成与根、茎形态明显不同的根茎部位，直径增加到2.84 mm（定植后60 d），较营养生长期增加15.45%；膨大期，根茎部位继续发育增粗，较前期有明显的膨大，根茎直径3.04 mm（定植后75 d），其上根茎芽也开始形成和发育；膨大后期，根茎部位继续膨大增粗，且根茎直径增加速度较快，达到3.97 mm（定植后90 d），较膨大期增加30.59%，同时表皮颜色加深，根茎芽进一步发育，芽体开始变得饱满。

图1 不同发育时期芍药根茎形态的变化Fig.1 Changes of herbaceous peony rhizome morphology at different developmental stages

2.2 不同发育时期芍药根茎内源激素含量的变化

通过比较不同发育时期的差异激素（图2）可以发现，发育前期（Ⅰvs Ⅱ）差异激素最多，共有39 种差异激素，其中19 种上调，20 种下调；发育中期（Ⅱvs Ⅲ）也有35 种激素被显著调节，19 种上调，16种下调；发育后期（Ⅲvs Ⅳ）差异激素显著减少，只有21 种，且大部分显著下调，只有4 种激素上调；总体来看，营养生长期（Ⅰ）和膨大后期（Ⅳ）相比共有36种激素被调节，其中23种上调，13种下调。

图2 不同发育时期芍药根茎内源激素差异韦恩图Fig.2 The venn diagram of endogenous hormone differences in herbaceous peony rhizome at different developmental stages

结合图3 和图4 对不同发育时期激素含量进行分析，可以看出，不同发育时期呈现不同的激素分布。在营养生长期，细胞分裂素类表达量较高的主要是一些活性不高的物质，活性较高的反式玉米素（tZ）、N6-异戊烯腺嘌呤（IP）等细胞分裂素含量极低；生长素类主要为色胺（TRA）、吲哚乙酸-天冬氨酸（IAA-Asp）等合成生长素的前体物质，活性形态的生长素类如IAA和IBA表达量极低，只有2.95 ng/g和0.22 ng/g；另 外 表 达 量 较 高 的GA8、GA19、GA24、GA53等均不属于赤霉素类的活性形式。因此，说明这个时期芍药实生苗根茎部位仍然是以营养生长为主，还未向膨大阶段转换。根茎转换期，占据主导地位的内源激素种类是活性游离的ABA 以及GA1、GA7、GA4、GA3等活性较高的赤霉素类，其中ABA 和GA3含量急剧增加，达到峰值，分别为94.96、541.53 ng/g，同时细胞分裂素类中活性较高的玉米素核苷（tZR）和tZ 表达量也达到最高，分别为1.33 ng/g 和0.28 ng/g，说明此时根茎部位在ABA和GA3的共同调控下，开始由营养生长向增粗膨大转变，细胞分裂开始变得比较旺盛。根茎发育后期，表达量较高的激素种类以生长素类和细胞分裂素类为主。根茎膨大期，ABA 和GA3表达量显著降低，其中ABA 降到52.07 ng/g，GA3更是急剧降低到11.84 ng/g，与此同时主要的生长素类如IAA（11.75 ng/g）、IBA（1.11 ng/g），活性较高的细胞分裂素类如tZ（0.28 ng/g）和IP（0.15 ng/g）及顺式玉米素（cZ，0.38 ng/g）则呈现较高的表达趋势，表明在前期激素调控的基础上，根茎部位处于稳定的膨大状态，并且这个时期根茎芽开始形成并发育，细胞分裂及生长比较旺盛，生长素类和细胞分裂素类物质对于根茎的膨大发育具有积极作用。膨大后期，个别活性较高的生长素类物质如IAA、细胞分裂素类物质如6-苄氨基嘌呤（BAP）有一定的表达量，维持根茎部位的继续增粗和膨大，其余表达量较高的激素均不具备较高的活性，大多数激素的表达量降至低位。

图3 不同发育时期芍药根茎内源激素差异热图Fig.3 The clustering thermogram of endogenous hormone differences in herbaceous peony rhizome at different developmental stages

图4 不同发育时期芍药根茎主要内源激素含量的变化Fig.4 Changes of main endogenous hormones contents in herbaceous peony rhizome at different developmental stages

2.3 不同发育时期芍药根茎碳水化合物含量的变化及其与直径的相关性

淀粉和糖类是植物营养物质积累的主要形式。从图5可以看出，随着根茎的形成和膨大，葡萄糖和果糖等还原性糖在营养生长期含量最高，随后呈逐渐下降的趋势，尤其是在根茎转换期急剧下降，下降幅度分别达到48.91%和93.25%，随后一直处于较低水平。蔗糖含量呈逐渐上升的趋势，前期增长缓慢，从根茎转换期到膨大期显著增加，在膨大期达到峰值（76.64 mg/g），在根茎形态上体现为根茎部位明显膨大。与此同时，淀粉含量总体呈现波动上升趋势，根茎转换期显著增加，从107.9 mg/g 增加到199.05 mg/g，增加幅度达到84.48%，随后一直保持较高水平，在膨大后期达到峰值（217.70 mg/g），显著高于前3个时期。

图5 不同发育时期芍药根茎淀粉和部分糖类含量的变化Fig.5 Changes of starch and some sugars in herbaceous peony rhizome at different development stages

对芍药根茎直径与糖、淀粉含量的相关性进行分析，结果表明，葡萄糖、果糖等还原性糖含量随着根茎直径的增加逐渐降低，相关系数分别为-0.819 0和-0.668 8，呈显著负相关；蔗糖和淀粉含量随根茎直径的增加而逐渐上升，相关系数分别为0.780 1和0.802 9，呈显著正相关。

3 结论与讨论

芍药是典型的根茎类多年生草本植物。播种繁殖是芍药杂交育种的重要环节，芍药种子具有上下胚轴双重休眠的特性[23]，杂交种子播种后，下胚轴首先突破种皮形成胚根，经过低温环境后，上胚轴发育形成胚芽。在实生苗发育的过程中，上下胚轴结合的地下部位逐渐增粗发育，形成根茎，并在其上着生地下芽，因此，根茎部位对于芍药实生苗是植株更新发育的关键结构，加快芍药实生苗根茎生长及根茎芽的初始形成和发育是提高芍药播种繁殖效率的重要途径。本研究以芍药实生苗为材料，研究了根茎形成和发育过程中主要内源激素及碳水化合物的变化。

一般来说植物储藏器官的形成和发育都是在各种激素的相互作用下完成的，并且每类激素所起的作用不同。ABA 和GA3是植物体内2 种经典的激素，二者在种子休眠与萌发、根的发育及开花等方面都表现出拮抗的生物学效应[24]，但是GA3并不总是作为ABA 的拮抗激素发挥作用，例如在唐菖蒲、百合休眠解除早期GA3抑制休眠解除，与ABA 作用相似[25-26]，本研究中芍药实生苗在根茎转换期（Ⅱ）ABA和GA3同时达到峰值，随后同步呈下降趋势，说明二者在根茎由营养生长到根茎膨大形成的转换阶段共同起到了决定性的调节作用。细胞分裂素类和生长素类对储藏器官的发育起重要作用，细胞分裂素类通过促进细胞分裂影响根茎的生长和膨大，生长素类通过调节细胞发育来促进器官的发育，二者在芍药根茎转换期和膨大期表达量较高，也是芍药根茎膨大发育的重要激素，这与茭白嫩茎膨大期间细胞分裂素含量显著上升，莲藕根茎膨大与IAA含量呈正相关的研究结论相符[27-28]。

碳水化合物是根茎形成的物质基础，其中蔗糖和淀粉在高等植物中充当主要的储藏化合物，在库器官中积累（例如种子、球茎、根和芽），马铃薯和百合转录组分析表明，蔗糖和淀粉代谢参与块茎转化和芽到小球的转变[29-30]。芍药根茎在形成发育过程中葡萄糖和果糖等还原性糖含量显著下降，被消耗或转化，淀粉和蔗糖含量整体呈上升趋势，是营养物质存储的最终形式，对于根茎的膨大发育十分重要，这与山药块茎发育过程中蔗糖和淀粉含量逐渐增加的结果基本一致[31]。

综合上述，芍药实生苗根茎形成和发育的不同阶段内源激素及碳水化合物呈现不同的分布，营养生长期各类激素处于前期积累阶段，根茎转换期ABA 和GA3含量达到峰值，决定了芍药根茎部位由营养生长向根茎形成转换，生长素类和细胞分裂素类则对根茎的膨大发育具有重要调节作用，淀粉和蔗糖作为储藏器官积累的主要碳水化合物，在根茎的形成和膨大过程中呈逐步增加的趋势。因此，是否可以通过外施植物生长调节剂和营养物质来调节芍药实生苗根茎的形成和发育还有待于进一步研究。