基于网络药理学探讨艾草抗鸡马立克病毒的活性成分与作用机制

马圣明，张福良，翁少亭，邢月腾，王 尧，张坤朋

（安阳工学院 河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室，河南 安阳 455000）

鸡马立克病（Marek’s disease，MD）是由马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）感染鸡引发的一种重要的免疫抑制病及肿瘤病。MDV 感染宿主后不仅能够诱发淋巴瘤，其导致的免疫抑制还极易并发或继发感染其他病原微生物[1]。目前，尚缺乏治疗MD 的有效药物，我国防控MD 的方法主要是疫苗免疫。近年来，随着鸡群MD 疫苗长期而广泛的应用，在免疫压力选择下MDV对疫苗的免疫耐受能力不断增强，流行毒株也在不断进化[2]。在我国，MDV 的流行也导致了MD 疫情的频繁暴发，长期给家禽养殖业造成巨大经济损失[3]。因此，亟需开发新型的、特异性的有效药物或生物制剂。

中药作为我国的民族瑰宝，在病毒性疾病的防治中具有疗效显著、毒副作用小等优势。艾草（Artemisia argyiLévl.et Van.）为菊科蒿属植物，是中国传统的道地中药。研究表明，艾草药理学作用十分广泛，含有抗病毒、抗菌、抗肿瘤等多种有效的药理活性成分[4]。网络药理学是借助于在线数据库、高通量分析及计算机模拟等手段，通过构建疾病-靶点-药物网络，实现对天然植物中药的活性成分、作用靶点与机制等进行预测的一种有效途径[5]。基于此，利用网络药理学手段筛选艾草的主要药理活性成分，挖掘潜在作用靶点，建立艾草抗MDV 的化合物-靶标-通路-疾病网络，结合分子对接技术，从系统生物学整体角度探究艾草中抗MDV 的活性成分，并探究潜在的作用机制，为临床应用艾草及其提取物治疗MD提供重要理论基础。

1 材料和方法

1.1 艾草药理活性成分及靶点的筛选

登录中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），检索艾草化学成分。设置口服利用度（OB≥30）和类药性（DL≥0.18）参数，筛选具有潜在药用价值的艾草活性成分。参考相关文献，补充艾草黄酮类药理活性成分异泽兰黄素和棕矢车菊素[6-7]。利用TCMSP 平台收集艾草活性成分对应的蛋白质靶点，并将靶点导入STRING 数据库（https：//cn.string-db.org/）转换为对应的基因名。

1.2 MDV相关宿主靶点的获取

根据参考文献，挖掘MDV 感染相关宿主基因[8]。将艾草活性成分对应的蛋白质靶点和MDV宿主基因信息输入Bioinformatics&Systems Biology数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行映射获得交集靶点，即艾草活性成分针对MDV相关宿主的关键靶点基因，并绘制韦恩图。

1.3 蛋白质互作网络（PPI）构建

将艾草活性成分针对MDV 相关宿主的关键靶点基因输入STRING 在线数据库（https://cn.string-db.org/）构建PPI 网络。将PPI 网络数据输入Cytoscape 3.8.0 软件中，借助Network Analyzer 进行拓扑分析。选取度、中心度、平均最短路径变化量和接近中心性4 个参数为参考标准。通过度值排序，选择度值大于平均分的基因为核心靶点。

1.4 活性成分-靶点网络构建与分析

将艾草活性成分和关键靶点基因输入Cytoscape 3.8.0 软件，建立艾草活性成分-关键靶点网络。同时，利用Cytoscape 3.8.0 软件中的Network Analyzer 功能分析网络，依据度值排序，筛选艾草抗MDV的重要活性成分。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

将艾草抗MDV 的关键靶点以文本形式输入DAVID 在线数据库（https://david.ncifcrf.gov/），阈值设定为P值小于0.05，物种选择为Gallus，进行GO功能分析和KEGG 通路富集分析。利用GraphPad Prism 6绘制GO 功能柱状图；借助Bioconductor 中的R软件包制作KEGG Pathway气泡图。

1.6 分子对接

从Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取靶点蛋白的晶体结构，保存为PDB 格式。利用pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取小分子药物的3D 坐标文件，并转换为PDB 格式。将靶点蛋白的晶体结构和小分子药物分别输入AutoDock 软件进行分子对接，并计算结合自由能（Affinity）。若结合自由能小于0 kcal/mol，则表明小分子配体与受体蛋白能够自发结合，且结合自由能越低，小分子配体与受体蛋白结合能力越强。

2 结果与分析

2.1 艾草潜在活性成分及靶点筛选

在TCMSP 数据库中检索获得135 个艾草的化学成分，根据预先设定的口服利用度和类药性参考值，筛选得到9 个化学成分。去除无靶点的化学成分，如4-亚甲基环烷酮（4-methylenecyloartanone）、达玛二烯醇乙酸酯（Dammaradienyl acetate）、乙酸环阿屯酯（Cycloartenol acetate）。考虑到可能存在漏选情况，补充了艾草抗病毒活性成分异泽兰黄素和棕矢车菊素，最终获得8 个艾草活性成分（表1）。在线检索各成分的药理作用靶点，去重后共获得156个蛋白质靶点。

表1 艾草活性成分信息Tab.1 Information on active ingredients of Artemisia argyi Lévl.et Van.

2.2 艾草抗MDV药物靶点筛选

挖掘MDV 感染相关宿主基因，去重后获得3 651 个基因，即MDV 的潜在宿主基因靶点。利用Bioinformatics&Systems Biology 数据库将艾草潜在活性成分对应的蛋白质靶点和MDV 宿主基因靶点进行映射获得108个靶点（图1），即艾草活性成分抗MDV的药物靶点。

图1 艾草抗MDV靶点韦恩图Fig.1 Venn plot of the target of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.3 艾草抗MDV潜在靶点PPI网络

将得到的108 个靶点导入STRING 在线数据库。选择物种原鸡（Gallus gallus），设定最低要求的互作分数为0.9，构建PPI 网络（图2）。节点数为107，边数为81，预期的边数为0，平均节点度值为1.51，平均局部聚类系数为0.368，数据保存为tsv 文件。将文件导入Cytoscape 3.8.0 软件进行拓扑分析，以节点度值作为拓扑学筛选标准绘制柱状图（图3）。结果显示，度值排名前9 位的靶点包括JUN、CCND1、CDK1、IL-6、AKT1、MAPK1、CASP3、CDK2、RB1。

图2 艾草抗MDV潜在靶点PPI网络Fig.2 Potential target protein interaction network of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

图3 艾草抗MDV潜在靶点度值排序Fig.3 Ranking of degree values of potential targets of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.4 艾草抗MDV活性成分-靶点网络构建与分析

制作108 个艾草抗MDV 潜在靶点与对应的活性成分文本，输入Cytoscape 3.8.0 软件，构建活性成分-靶点网络。结果如图4所示，网络图中红色代表艾草的活性成分，蓝色代表活性成分的作用靶点，节点度值越大，图形越大。根据度值大小最终筛选出主要活性成分槲皮素（Quercetin，MOL000098）、异泽兰黄素（Eupatilin，MOL005734）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol，MOL000358）、棕 矢 车 菊 素（Jaceosidin，MOL000297）。结果表明，艾草抗MDV是基于多种药理活性成分、多个靶点基因的协同复杂作用。

图4 艾草-成分-靶点相互作用关系网络Fig.4 The interaction network of Artemisia argyi Lévl.et Van.-component-target

2.5 艾草抗MDV潜在靶点蛋白GO富集分析

将筛选出的108 个艾草抗MDV 靶点导入DAVID 数据库进行GO 功能分析。根据P值小于0.05，筛选到161 个生物过程条目、22 个细胞组分条目、46 个分子功能条目。对排名前10 位的GO 条目进行可视化分析，结果显示，艾草抗MDV 机制涉及细 胞 核（Nucleus）、胞 浆（Cytosol）、细 胞 质（Perinuclear region of cytoplasm）等细胞组分，并与细胞对镉离子的应答（Cellular response to cadmium ion）、细胞对活性氧的应答（Cellular response to reactive oxygen species）、内皮细胞增殖的正调控（Positive regulation of endothelial cell proliferation）等过程相关（图5）。结果提示，艾草抗MDV 主要体现在细胞活性、炎症反应等方面。

图5 艾草抗MDV潜在靶点蛋白GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of potential targets of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.6 艾草抗MDV潜在靶点蛋白KEGG富集分析

对108 个艾草抗MDV 靶点进行KEGG 富集分析（P＜0.05）。结果显示，共富集到23 条通路，主要包括C 型凝集素受体信号途径（C-type lectin receptor signaling pathway）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、细胞衰老（Cellular senescence）、p53 信号途径（p53 signaling pathway）、细胞凋亡（Apoptosis）等过程（图6）。结果提示，艾草活性成分可能通过靶向作用于细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、炎性反应等关键信号通路来发挥抗MDV作用。

图6 艾草抗MDV潜在靶点蛋白KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of potential targets of Artemisia argyi Lévl.et Van.anti-MDV

2.7 异泽兰黄素与关键靶点分子对接

选取艾草代表性活性成分异泽兰黄素，分别与度值排名前4 位的关键靶点JUN、CCND1、CDK1、IL-6进行分子对接。结果显示，JUN蛋白的TRP-57和TRP-76 残 基，CCND1 蛋 白 的ARG-101、ALA-16、LYA-142 残基，IL-6 蛋白的LYS-33 残基，CDK1蛋白的ARG-182、ARG-179 和GLN-175 残基与异泽兰黄素相互作用。异泽兰黄素与JUN 蛋白、CCND1蛋白、IL-6蛋白、CDK1蛋白的分子对接结合自 由 能（Affinity）分 别 为-6.4、-7.7、-6.2、-7.2 kcal/mol（图7）。以上结果提示，异泽兰黄素与JUN、CCND1、CDK1、IL-6 蛋白均能自发结合，其中与CCND1的结合能力最强。

图7 异泽兰黄素与靶点蛋白对接模式图Fig.7 Docking pattern diagram of eupatilin and target proteins

3 结论与讨论

近年来，伴随着鸡群MD 疫苗长期而广泛的应用，MDV 流行毒株不断进化，部分流行毒株已在一定程度上突破传统疫苗免疫保护[9-10]。因此，开发有效的抗病毒药物对于预防和控制MD 具有重要意义。目前，天然中草药及其活性成分的生物学功能研究已成为医学工作者关注的热点，并广泛应用于临床。艾草是我国传统道地中药，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性[4]。研究表明，艾草对流感病毒、牛病毒性腹泻病毒、乙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒等多种病毒均具有抑制效果[11-14]。然而，艾草抗病毒作用机制仍不清楚，只停留在粗提物的有效剂量水平，对其具体抗病毒活性成分、调节的信号转导通路、作用的靶蛋白等药理机制方面还需深入探索。

网络药理学可从系统生物学网络的角度分析药物与治疗对象之间的分子联系，广泛应用于发现和解释药物和中药的潜在作用机制[15]。口服利用度和类药性筛选大大提高了候选药物的准确性和有效性。根据OB≥30、DL≥0.18，筛选获得有靶点的艾草潜在活性化合物6 个。研究表明，异泽兰黄素体外能有效抑制EB 病毒增殖活性[6]。棕矢车菊素可抑制人乳头状瘤病毒的复制[7]。据此，补充了异泽兰黄素和棕矢车菊素。通过蛋白质互作PPI网络分析，艾草活性成分抗MDV 的主要作用靶点为JUN、CCND1、CDK1、IL-6、AKT1、MAPK1、CASP3、CDK2、RB1。JUN 是MARK 信号通路下游的关键分子，在调控细胞增殖与凋亡中发挥重要作用[16]。CCND1起着调节CDK 激酶的作用，参与调控细胞周期和细胞增殖[17]。AKT1 是苏氨酸蛋白激酶家族的一个活性蛋白，磷酸化的AKT 可参与调节细胞周期的多个进程[18]。IL-6 是参与抗感染免疫的重要分子，病毒感染可诱导IL-6的释放，并通过级联反应激活或扩大炎症反应[19]。MARK 是丝裂原活化蛋白激酶，MAPK1 活化或促进CASP3 表达，诱导病毒感染细胞发生凋亡[20]。

构建艾草活性成分-靶点网络发现，槲皮素、异泽兰黄素、β-谷甾醇、棕矢车菊素等化合物可能是艾草抗MDV 作用的关键药理活性成分。槲皮素是存在于多种天然植物中的一种黄酮类化合物，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗溃疡等药理学作用[21]。目前，槲皮素的广谱抗病毒活性已被各种科学研究充分证明，如抗SARS 相关冠状病毒、抗甲型流感病毒、抗肝炎病毒、抗埃博拉病毒和抗疱疹病毒活性等。研究表明，异泽兰黄素在药理学浓度下可促进EB 病毒感染的SNU-719 细胞死亡[6]。β-谷甾醇体外预处理显著抑制炎症因子的表达，同时显著减缓了脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤症状，表现出良好的免疫调控和抗炎活性[22]。另有研究表明，棕矢车菊素抑制人乳头状瘤病毒的半数有效质量浓度为5 μg/mL，最小有效质量浓度为10 μg/mL，且无细胞毒性[7]。本研究发现，艾草单一活性成分往往可以作用多个靶点蛋白，一个靶点蛋白又可同时被多个不同的活性成分干预。不同活性成分和不同靶点蛋白之间可直接或间接作用，构成复杂的相互作用网络，表明艾草抗MDV效应可能是基于多种活性成分作用于多个靶点的协同作用。此外，GO 富集和KEGG 通路分析涉及细胞生长、免疫代谢等多个细胞生物学进程和免疫信号途径。因此，推测槲皮素、异泽兰黄素、β-谷甾醇、棕矢车菊素等艾草活性成 分 可 能 以JUN、CCND1、CDK1、IL-6、AKT1、MAPK1 等基因为药理作用靶点，通过调控细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、炎性反应等关键信号通路来发挥抗MDV作用。值得一提的是，异泽兰黄素是广泛存在于菊科植物属中的一种活性成分，且尤以艾草中的含量最高[4]。分子对接验证显示，异泽兰黄素与核心靶点CCND1 的对接能力最强，说明CCND1可能在抗MDV中发挥重要作用。

综上，本研究借助网络药理学手段，预测了艾草抗MDV的活性成分及药理作用靶点，分析了潜在的抗病毒分子机制，表明艾草主要活性成分异泽兰黄素可能作用于CCND1，通过介导细胞周期干预细胞增殖，从而发挥抗MDV效应。