甲亢患者血清miR-133a水平变化与甲状腺激素及脂质代谢的关联性研究

黄宝乐, 吴 峰, 岳 悦, 郑桂玲

甲状腺功能亢进(简称甲亢)是一种病理综合征,其特征是循环甲状腺激素(thyroid hormone,TH)水平升高[1]。除了与TH水平升高直接相关的典型临床症状,如静息能量消耗增高、体重减轻外,甲亢患者还可能伴有脂质代谢紊乱[2]。越来越多的研究表明TH在调节脂质代谢中起重要作用[3],但其具体机制尚未完全阐明。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类小的非编码单链RNA分子,含有22～25个核苷酸,能够结合到其靶mRNA的3′非翻译区,导致翻译抑制或mRNA降解[4]。全基因组miRNA-mRNA表达谱数据也揭示了TH对幼鼠肝脏miRNA具有潜在的调节作用[5]。在甲状腺机能减退小鼠的肝脏中,可观察到miR-133a表达显著增加,而在甲状腺机能亢进小鼠肝脏,其表达水平下调[6]。有研究显示,miR-133a参与胆固醇合成和肝脏脂质代谢[7]。鉴于TH和miR-133a都参与调节能量消耗和脂质代谢,笔者推测miR-133a可能在TH调节的脂质代谢中发挥一定的作用。据此,本研究分析了甲亢患者在甲巯咪唑治疗前后血清miR-133a水平变化及其与TH和脂质代谢的关联性,现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2020年10月至2022年8月中国人民解放军联勤保障部队第九八三医院内分泌科收治的新发显性甲亢患者100例(甲亢组),其中男28例,女72例,年龄18～69(40.53±11.06)岁。纳入标准：(1)有典型的临床症状,血清TH水平升高,促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)水平降低,TSH受体抗体(TSH receptor antibody,TRAb)水平升高或正常,符合显性甲亢的诊断[8];(2)临床资料完整;(3)入院前未接受甲亢相关治疗。其中28例甲亢患者在入组后接受了2个月的标准甲巯咪唑治疗(20 mg/片,1片/次,1次/d)。另招募同期健康体检者100名作为对照组。两组排除标准：(1)年龄<18岁;(2)体质量指数(body mass index,BMI)>30.0 kg/m2;(3)合并已知的心血管疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和肾损害(血清肌酐：男性>133 μmol/L,女性>106 μmol/L);(4)服用已知影响TH代谢的药物;(5)吸烟。本研究获中国人民解放军联勤保障部队第九八三医院医学伦理委员会批准[批号：伦审办2020第(54)号],研究对象签署知情同意书。

1.2生化指标检测 入院后在治疗前采集静脉血5 mL,4 ℃下以1 500 r/min离心10 min,分离血清。小心地将上清液转移到无RNase/DNA酶的冷冻瓶中,-80 ℃保存备检。采用电化学发光免疫分析法检测血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)和TSH水平,试剂盒购自瑞士Roche Diagnostics公司。采用比色酶法测定总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)和直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)水平。上述指标均通过奥林巴斯AU640自动生化分析仪(日本东京奥林巴斯公司)进行检测。

1.3血清miR-133a水平检测 通过实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进行检测。使用QIAzol试剂(美国Applied Biosystems公司)提取800 μL血清总RNA,并通过miRNeasy-血清试剂盒(美国Applied Biosystems公司)进行分离和纯化。应用特异性TaqMan miRNA分析试剂盒(美国Applied Biosystems公司)将总RNA逆转录合成第一链cDNA。采用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]通过实时荧光定量PCR法检测血清miR-133a水平。反应体系：5 μL miRcute Plus miRNA PreMix,上游和下游引物各0.2 μL,2.6 μL ddH2O。反应条件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,40个循环(94 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min)。所用引物序列见表1。以U6为内参,通过2-ΔΔCT法计算miR-133a的相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1两组一般临床资料比较 与对照组相比,甲亢组FT4、FT3、TRAb、舒张压、ALT、TBIL和DBIL水平较高,BMI、腰围、TC、TG、LDL-C、TSH水平较低,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组一般临床资料比较

2.2两组血清miR-133a水平比较 甲亢组血清miR-133a水平低于对照组,差异有统计学意义(Z=9.796,P<0.001),见图1。

图1 两组血清miR-133a表达水平比较图

2.3甲亢患者血清miR-133a水平与TH及脂质代谢指标参数的相关性分析结果 甲亢患者血清miR-133a水平与ALT(rs=-0.381,P<0.001)、FT3(rs=-0.319,P=0.001)、FT4(rs=-0.404,P<0.001)水平呈负相关,与TC(rs=0.500,P<0.001)、LDL-C(rs=0.337,P=0.001)和TSH(rs=0.214,P=0.033)水平呈正相关。经校正年龄、性别和BMI变量后,偏相关分析结果显示血清miR-133a水平与TC(rs=0.372,P=0.001)和TSH(rs=0.254,P=0.016)水平仍呈正相关,与FT3水平仍呈负相关(rs=-0.271,P=0.009)。

2.4甲巯咪唑治疗对甲亢患者代谢指标参数及血清miR-133a水平的影响结果 28例经甲巯咪唑治疗的甲亢患者在随访期间未观察到严重不良事件发生。与治疗前相比,其血清FT3和FT4水平降低,TC、LDL-C和TSH水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在接受甲巯咪唑治疗后,患者血清miR-133a水平较治疗前显著上调(P<0.05),见表3。Spearman秩相关分析结果显示,治疗前后血清miR-133a水平变化值与FT3(rs=-0.728,P<0.001)、FT4(rs=-0.377,P=0.048)水平变化值呈负相关,而与TC、TG、LDL-C和TSH水平变化值相关性不显著(P>0.05),见图2。经校正年龄、性别和BMI的变量后,偏相关分析结果显示血清miR-133a水平变化值仍与FT3变化值呈负相关(rs=-0.690,P<0.001)。

图2 甲巯咪唑治疗前后血清miR-133a水平变化值与FT3、FT4水平变化值的散点图

表3 甲巯咪唑治疗对甲亢患者代谢指标参数及血清miR-133a水平的影响结果

3 讨论

3.1本研究结果显示,新发甲亢患者血清miR-133a水平降低,经甲巯咪唑治疗后其水平上升。经校正年龄、性别和BMI因素后,偏相关分析结果显示甲亢患者血清miR-133a水平与TC、TSH水平呈正相关,与FT3水平呈负相关,且在甲巯咪唑治疗前后miR-133a水平变化值与FT3、FT4水平变化值相关。这些发现揭示了甲亢患者甲状腺功能与血清miR-133a水平之间存在相关性。

3.2TH对正常的生长、发育和代谢至关重要。研究表明,TH水平与体质量及能量消耗有关[9]。甲亢患者因TH分泌过量,促进以静息能量消耗增加、体质量减轻为特征的高代谢状态,导致血清TG和TC水平降低[10]。本研究结果亦显示甲亢患者的血脂、BMI和腰围水平降低。据报道,TH主要通过调节基因转录的特定核受体影响TG、TC的产生[11]。越来越多的证据也表明,miRNA机制也可能参与TH的代谢调节[12]。本研究结果表明,与甲状腺功能正常的对照组相比,甲亢组血清miR-133a水平显著降低。因此,探讨TH与miR-133a之间的关系可能有助于进一步了解甲亢患者代谢功能障碍的发生机制。

3.3肝脏是TH调节能量代谢和生理功能的重要器官,甲亢患者多合并肝功能不全,甲状腺功能减退与非酒精性脂肪性肝病相关[13-14]。有研究表明,三碘甲状腺原氨酸具有降低血脂水平的能力,包括TC和TG[11,15]。肝脏中的脂质代谢涉及许多基因,而TH对其具有调节作用,包括一些miRNA。Zheng等[15]观察到抑制内源性miR-206表达可降低HepG2细胞TG和TC的表达;相反,miR-206过表达可抑制T3治疗诱导的TG水平降低。越来越多的研究证据也表明,miRNA参与脂质代谢中基因的转录后调节[16-17]。Ioannidis和Donadeu[7]的研究显示,miR-133a在TC处理中的调节作用是组织特异性的。肌肉释放的循环外泌体携带特定miRNA,例如miR-133a和miR-133b水平上调,进而诱导肝脏基因表达变化,从而改善代谢谱[18]。此外,Peng等[19]的研究发现,miR-133a可以直接调节RAW 264.7巨噬细胞中睾丸孤儿核受体4的表达,从而减少CD36介导的脂质积累。Fu等[20]则证实了miR-1、miR-133a和miR-206a在比目鱼肌肉发育中具有重要的调节作用,并直接或间接受到TH的调节。Diniz等[21]认为,TH水平升高可诱导miR-133a表达降低,进而促进1型血管紧张素Ⅱ受体诱导的心肌肥厚,虽然该观点并未在本研究中得到证实,但其发现也为TH与miR-133a关系研究提供了参考。

3.4在本研究中,只有28例甲亢患者严格遵医嘱接受甲巯咪唑治疗,结果显示,在接受治疗后患者血清miR-133a水平较治疗前显著升高,且其血清miR-133a水平变化值与FT3、FT4变化值呈负相关。笔者推测甲亢患者血清miR-133a水平降低可能部分归因于TH表达过量。

3.5本研究也有一定的局限性：(1)仅检测了甲亢患者血清miR-133a水平,其在肝脏中的表达水平未能测定;(2)本研究为非随机对照试验,可能存在一定的选择偏倚;(3)样本量相对较少,随访时间短,单中心研究的性质等可能阻碍了本研究结果的推广。

综上所述,甲亢患者血清miR-133a水平降低,且伴随着血脂代谢紊乱,血清miR-133a水平与TC、LDL-C水平呈正相关。经甲巯咪唑治疗后甲亢患者血清miR-133a水平有所升高,这可能部分归因于FT3、FT4水平变化,但miR-133a在甲亢患者的脂质代谢中发挥作用的分子机制仍有待进一步验证。