宫颈脱落细胞HPVE6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查与HPV分型诊断中的应用

任玉峰 王兆辉 段秀芳 徐娜 张妍

宫颈癌是妇科常见三大恶性肿瘤之一，近年来，年轻女性宫颈癌的发病率呈逐渐上升的趋势。临床研究结果显示，医学干预可有效预防宫颈癌的发生，及早筛查和诊断癌前病变且配合治疗，治愈率在90%以上［1］。宫颈癌癌前病变早期缺乏特异性临床表现，不易察觉，早期筛查对患者的诊断显得尤为重要。人乳头瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染与宫颈癌的发生发展密切相关，尤其是高危型人乳头瘤病毒感染（highrisk human papilloma virus， HR-HPV）患者，癌变风险显著增加［2］。HPV内部的E6/E7癌基因表达产生E6/E7癌蛋白，E6蛋白通过抑制P53而阻断凋亡，E7蛋白抑制pRB使细胞周期失控，致使宫颈癌的发生。而HPV E6/E7 mRNA是E6/E7癌基因表达的直接产物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宫颈病变开始和进展为宫颈癌的必要条件。因此，HPV E6/E7 mRNA检测是宫颈癌风险程度的重要评估方法［3］。HPV E6/E7 mRNA 阳性率及拷贝数与宫颈癌中HPV的分型有无相关性，尚不明晰。本研究收集安康市妇幼保健院268例宫颈癌疑似患者的临床病历资料，探讨宫颈脱落细胞E6/E7 mRNA对宫颈癌与HPV分型的诊断价值，旨在为临床进一步病理活检和早期临床干预提供依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月至2020年3月安康市妇幼保健院收治的268例疑似患者作为研究对象。年龄22～65岁，平均（40.72±9.147）岁；身体质量指数（body mass index，BMI）为（20.35±1.92）kg/m2。宫颈癌诊断标准以组织学诊断结果为金标准。根据病理诊断意见分为宫颈癌组（n=140）和非宫颈癌组（n=128）；268例患者根据HPV分型结果分为高危型组（n=212）和非高危型组（n=56，包括低危型组15例，低危混合组41例）。纳入标准：①患者可见接触性出血，绝经患者可见阴道不规则出血或白带带血；②B超或CT检测发现宫颈赘生物；③白带增多；④患者及家属知情同意，并自愿签署知情同意书。排除标准：①患者术前进行过放化疗史；②合并急性妇科炎症者；③合并其它恶性肿瘤者。本研究通过伦理委员会审批（审批文件号：2018031）。

1.2 检查方法 宫颈脱落细胞收集：收集前3 d禁止性生活，并用生理盐水冲洗阴道。采用内窥器扩张阴道，暴露宫颈。将宫颈细胞专用刷插入宫颈口，顺时针旋转5周，采集脱落宫颈细胞。留置在专用杯中，编号，冷冻保存备用。

HPV E6/E7 mRNA检测：采用支链DNA技术（b-DNA）检测HPV E6/E7mRNA。取备用宫颈脱落细胞标本，离心取上清液送检。以200 μL裂解液+400 μL双蒸水+5 μL蛋白酶K对标本进行裂解。将裂解后的标本液50 μL加入样本检测孔，并加入50 μL标本缓冲液，加载好后封闭，55℃孵育3.5 h。完成后以洗脱液洗板，依次加入预放大和放大分子、探针标记物各100 μL，每孔，期间均行55℃杂交处理。完成后46℃孵育0.5 h。采用冷光检测仪读取HPV E6/E7 mRNA拷贝数，以E6/E7＞1.0为结果阳性［4］。

HPV分型检查：采用YN-H18型全自动核酸分子杂交仪检测HPV E6/E7 mRNA，相应试剂盒购自亚能生物技术有限公司，操作严格按说明书进行。参照标准记录HPV分型［5］，以HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82型为高危型HPV，以HPV 6、11、42、43、44、81型为低危型HPV。高危型病毒单独感染及存在高危型病毒的混合感染定义为高危组；低危型病毒单独感染定义为低危组；低危混合型为低危型病毒混合感染；低危型和低危混合型总归于非高危组。

1.3 确诊方法 宫颈癌需要两名主治医师及以上职称进行病理诊断采用双盲法进行确诊，对于安康市妇幼保健院及宁夏第五人民医院两家医院意见不一致者，由第三家医院枣庄市立医院做诊断，最后对结果进行讨论，最终结果作为宫颈癌确诊病例。

1.4 观察指标 记录268例研究对象一般资料（年龄、BMI、文化程度、孕次、产次、吸烟史、初次性生活时间、性伴侣个数、阴道分泌物情况、甲状腺疾病、CA125、SCC、HPV分型）及HPVE6/E7 mRNA 拷贝数并进行分组比较。

1.5 统计学方法 选用SPSS 20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间行独立样本t检验，不符合正态分布时以M（P25，P75）表示，组间行秩和检验；计数资料以例和率表示，组间行χ2检验，多因素分析采用logistic回归分析，判断准确性采用受试者工作曲线（receiver operator characteristics， ROC）分析，结果以曲线下面积（area under the curve， AUC）表示，组间比较行Z检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者基本情况比较 宫颈癌组与非宫颈癌组年龄及BMI的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 宫颈癌和非宫颈癌组年龄及BMI比较（）

表1 宫颈癌和非宫颈癌组年龄及BMI比较（）

组别宫颈癌组非宫颈癌组t值P值例数140 128年龄（岁）40.03±8.665 41.47±9.625 0.319 0.750 BMI（kg/m2）20.43±2.051 20.12±1.892 0.259 0.796

2.2 不同患者HPV E6/E7 mRNA比较 宫颈癌与非宫颈癌组不同HPV分型组HPVE6/E7 mRNA阳性率和拷贝数差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、3。

表2 宫颈癌组和非宫颈癌组HPV E6/E7 mRNA比较

表3 高危型HPV组、低危型HPV组及低危混合型HPV组HPVE6/E7 mRNA 的比较

2.3 logistic多因素回归分析 纳入单因素分析中差异有统计学意义的变量进入多元模型（变量赋值见表4），采用逐步向前选择变量，以宫颈癌为因变量（否0，是1），结果显示：文化程度初中及以下、孕次≥3次、初次性生活时间＜18岁、鳞状细胞癌抗原（SCC）＞2 ng/mL及HPVE6/E7 mRNA阳性是宫颈癌的高危因素（P＜0.05）。见表5。以高危型HPV为因变量（否0，是1），结果显示：年龄（35～65岁），孕次≥3次、性伴侣≥3个、阴道分泌物异常及HPVE6/E7 mRNA阳性是高危型HPV的独立危险因素（P＜0.05）。见表6。

表4 变量赋值表

表5 宫颈癌logistic回归分析

表6 高危型HPV logistic回归分析

2.4 单项与联合检测宫颈癌的价值分析 以宫颈癌为状态变量，孕次、初次性生活时间、SCC、HPVE6/E7 mRNA和多项联合为检测变量绘制ROC曲线，结果显示：孕次、初次性生活时间、SCC、HPVE6/E7 mRNA 及多项联合的AUC分别为0.625、0.671、0.691、0.632和0.826，最佳截值分别为1.14次、47.76岁、1.96 ng/mL、47 969拷贝数、1.210。孕次、初次性生活时间、SCC、HPVE6/E7 mRNA 和多项联合具有良好的灵敏度和特异度，Z检验显示联合检测概率的AUC显著高于其他单项检测指标（P＜0.05）。见表7，图1。

图1 单项及联合检测判断宫颈癌的ROC曲线

表7 单项及联合检测宫颈癌的价值分析

2.5 单项与联合检测高危型HPV的价值分析 以高危型HPV为状态变量，年龄、孕次、性伴侣、阴道分泌物、HPVE6/E7 mRNA和多项联合为检测变量绘制ROC曲线，结果显示年龄、孕次、性伴侣、阴道分泌物、HPVE6/E7 mRNA 及多项联合的AUC分别为0.639、0.662、0.642、0.648、0.631和0.880，最佳截值分别为49.92岁、1.207次、3.025个、阴道分泌物异常、51735拷贝数、1.137。年龄、孕次、性伴侣、阴道分泌物、HPVE6/E7 mRNA 和多项联合具有良好的敏感度和特异性，Z检验显示联合检测概率的AUC显著高于其他单项检测指标（P＜0.05）。见表8和图2。

图2 单项与联合检测判断高危型HPV的ROC曲线

表8 单项及联合检测判断高危型HPV的价值分析

3 讨论

目前，宫颈癌是妇科仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤。HPV是具有双链环状结构的DNA病毒，当HPV感染宿主后以整合状态存在宿主细胞DNA后，可引起基因表达缺失或突变，同时影响抑癌基因正常表达［6］，在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用［7］，成为宫颈癌变的诱因。本研究显示年龄35～65岁是高危型HPV高发群体，可能是因该阶段患者性生活活跃，受孕、流产次数较多，造成的机械性损伤使高危型HPV感染机率增加［8］。临床也有学者发现高龄妇女因雌激素水平降低，机体免疫功能减退，使HPV防御能力下降，而年轻女性因对性行为认知的不同，性伴侣多，性行为时不注意安全卫生，高危型HPV感染率也在上升［9］。综上所述，笔者认为年龄在高危型HPV感染中的影响无直接相关性，是多种复杂因素协同的结果，年轻患者主要与性伴侣多有关，这与本文中的研究结果一致。另外，本研究发现孕次、阴道分泌物异常也是高危型HPV的独立影响因素，这与既往报道一致［10］。因而，改变不良生活习惯，注意身体卫生有助于降低HPV风险。但上述因素涉及个人隐私，可控性与稳定性较差［11］，临床有待更多的实验室指标检测及实验病例的扩充，以精准检测HPV分型和宫颈癌变风险。

宫颈脱落细胞学检查作为宫颈癌的早期筛查方法已在临床广泛应用，成为共识［12］。而E6、E7是HPV早期编码区的基因，报道证明E6可能利用泛素-蛋白酶体系降解PDZ蛋白，进而加快棘细胞层细胞恶性增殖，而E7可竞争性结合pRb CR2区特殊结构结合位点，抑制pRb抑瘤活性，诱导细胞恶变［13］。武振宇［14］研究显示，FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表达水平与宫颈病变程度存在显著相关性，宫颈病变程度越严重，FIS1mRNA表达量呈降低趋势，而HPV E6/E7 mRNA表达量呈上升趋势，与本文研究结果一致。相关研究显示，HPV E6/E7 mRNA 联合液基细胞学检查在宫颈癌筛查中有重要作用［15-17］。此外，还有报道显示E6、E7参与了高危型HPV 病毒免疫监视和免疫逃逸途径，使机体长期处于高危型HPV感染状态［18］，增加癌变机率。朱行行等［19］研究发现，高危型-HPV E6/E7 mRNA检测在新疆维吾尔族妇女宫颈病变分层管理中有着重要应用价值，可当作二线筛查指标。王小红等［20］研究发现，高危型HPV E6/E7 mRNA 表达水平有助于筛查宫颈癌变和HPV分型。这与本研究也发现HPV E6/E7 mRNA是宫颈癌与高危型HPV感染共同的高危因素，可能与此有关结果相一致。这也说明监测宫颈脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA表达水平有助于筛查宫颈癌变和HPV分型。

本研究通过logistic多因素回归分析探讨宫颈癌与高危型HPV的独立影响因素，比较HPV E6/E7 mRNA单项与多项联合检测对检测宫颈癌与HPV分型的价值，结果发现HPV E6/E7 mRNA多项联合检测较单项检测AUC显著提高，提示HPV E6/E7 mRNA多项联合检测有助于提高判断宫颈癌与HPV分型的准确性，其在筛查宫颈癌与检测HPV分型方面具有可行性。

综上所述，基于HPV E6/E7 mRNA检测的多项联合检测概率可用于宫颈癌筛查和高危型HPV的诊断。