糖尿病患者骨不连断端组织中成骨活性的差异性研究

刘 伟 张翠影（通信作者） 杨 帆 栾富均 何盛江 赵 强

（1 重庆医科大学附属永川医院创伤骨科，重庆 402160；2 重庆医科大学附属永川医院妇科）

糖尿病为终身性内分泌系统代谢疾病，近年随着人们生活水平的提高与生活方式的改变，糖尿病发生率不断提高，由此引起的并发症危害较多，已经成为继癌症、心血管疾病之后威胁人类健康的第三杀手。2 型糖尿病以胰岛素抵抗或胰岛素分泌缺陷为特征，是临床最常见的糖尿病类型，占比超过95%。现代研究发现，2 型糖尿病不仅可以引起多系统慢性损害，亦会造成组织修复障碍，导致患者骨折后愈合时间延长甚至骨不连，成为引起骨折患者残疾和死亡的主要因素，糖尿病骨折患者的康复问题也由此成为研究的重点。糖尿病患者骨不连断端组织的成骨活性通常会受到一系列因素的影响，包括高血糖、炎症反应、细胞凋亡等，例如，糖尿病患者的高血糖状态会导致骨细胞功能异常，影响骨愈合。同时，高血糖可导致成骨细胞凋亡增加，炎症反应加剧，抑制成骨细胞增殖和分化，从而影响糖尿病患者骨不连断端组织的成骨活性。另外，炎症反应还会导致糖尿病患者骨不连断端组织中的骨吸收增加，从而进一步影响成骨活性[1]。研究显示，成骨活性与骨不连密切相关，成骨细胞稀少或活跃度降低会对骨愈合造成影响[2]。糖尿病骨不连是糖尿病患者常见的并发症之一，其特征是骨折难以愈合。骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、核心蛋白多糖（DCN）和成纤维细胞生长因子（BFGF）是3 种与骨组织生长和修复密切相关的生长因子，它们在糖尿病骨不连的研究中具有重要意义。基于此，本研究选取2021 年6 月—2022 年6 月重庆医科大学附属永川医院收治的60 例行胫骨中下段骨折闭合复位髓内钉固定术的老年AO/OTA 1型骨折患者为对象，探究糖尿病骨折患者骨不连组织的成骨活性。现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

本研究选取重庆医科大学附属永川医院收治的60 例行胫骨中下段骨折闭合复位髓内钉固定术的老年AO/OTA 1 型骨折患者为研究对象，依据是否合并糖尿病将患者分为2 型糖尿病组（n=27）和非糖尿病组（n=33）。2 型糖尿病组男11 例，女16 例；年龄60～87 岁，平均年龄（68.36±5.42）岁；左侧骨折14 例，右侧骨折13 例；交通事故伤16 例，跌倒摔伤11 例；合并高血脂症12 例，心脑血管疾病7 例，高血压5 例，呼吸系统疾病5 例。非糖尿病组男13 例，女20 例；年龄61～89 岁，平均年龄（68.07±5.71）岁；左侧骨折18 例，右侧骨折15；交通事故伤19 例，跌倒摔伤14 例；高血压10 例，高脂血症8 例，心脑血管疾病6 例，呼吸系统疾病5 例。本研究已获院医学伦理委员会审批通过，2 组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（1）纳入标准：①外伤所致单侧胫骨中下段骨折，骨折AO/OTA分型为I型；②年龄 60 岁及以上；③行闭合复位髓内钉内固定治疗，术后规律康复锻炼；④无严重内科疾病及合并伤，一般状况良好；⑤基于WHO诊断标准，明确有无2 型糖尿病；⑥签署知情同意书。（2）排除标准：①合并I型糖尿病；②影响术后康复的严重并发症；③重度骨质疏松；④合并下肢功能障碍，无法自主配合康复及研究；⑤临床资料不全。

1.2 方法

2 组入院后均行患肢皮肤牵引或骨牵引术，同期完善相关检查，积极内科干预，2 型糖尿病患者控制空腹血糖在8.0 mmol/L以内，待各项指标达标、患者一般情况允许择期施术，受伤距手术时间1～7 d不等。手术采用连续硬膜外麻醉或全身麻醉，患者置于骨科手术牵引床上，于C型臂X线透视下完成髓内钉闭合复位内固定手术。术后常规抗炎，积极治疗伴发疾病，2 型糖尿病组患者根据实际情况使用二甲双胍、格列齐特等药物降糖，或以胰岛素或胰岛素联合降糖药物进行治疗。对于骨质质量好、术后X线线摄片显示对位对线良好的患者，鼓励早期下地活动，循序渐进康复训练，合并骨质疏松的患者，个体化扶拐或应用步行器部分负重，以后逐渐过渡到全部负重。骨延迟愈合者则采取适当制动与延长下地活动时间的办法，同时应用促骨愈合药物，联合加强营养、电疗、中医按摩等辅助治疗。术后均随访12 个月，期间2 组患者定期复查X线片，2 型糖尿病组每3 个月复查1 次糖化血红蛋白。

1.3 评价指标

（1）骨不连发生率。骨不连诊断标准：动态观察8个月骨折未愈合或有愈合倾向但未完全愈合，临床检查骨折部位异常活动或疼痛X线片可见骨折线清晰，断端无骨痂，或局部有硬化性骨痂但骨折端无愈合表现，或骨折端完全封闭，硬化吸收，假关节形成，成角畸形。

（2）骨折愈合质量。根据末次随访拍摄的骨折区X线片，观察各组骨折断端成骨变化，基于Lane-Sandhu X线评分标准评价骨折愈合情况[3]。Lane-Sandhu从骨形成、骨连接、骨塑性3 个维度进行评价，其中骨形成一项依据有无骨形成及骨形成占缺损程度分别记0 分（无骨形成）、1 分（占缺损25%）、2 分（占缺损50%）、3 分（占缺损75%）、4 分（充满缺损区），骨连接一项依据骨折线情况分别记0 分（清晰）、2 分（部分存在）、4 分（消失），骨塑型一项依据有无塑型及程度分别记0 分（无塑型）、1 分（形成髓腔）、2 分（皮质塑型），取各项计分之和，得分范围0～8 分，得分越高表示患者骨折愈合质量越好。

（3）骨组织形态学。末次随访，采集2 组骨不连患者骨折断端中心区域与外周区域的骨组织进行活检。标本以4%甲醛固定，Plunk液脱钙，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚度切片，苏木精-伊红染色后显微镜下观察骨组织形态。

（4）成骨活性。对2 组骨标本进行免疫组织化学检测，测定骨断端组织中骨生长因子BMP-2、DCN与BFGF的表达情况。标本切片一式三份，置于65℃烤箱中烘烤1 小时，再依次用二甲苯、梯度乙醇脱蜡脱水，抗原修复，3%双氧水灭活，分别滴加1：50 稀释的BMP-2、DCN与BFGF，4℃冰箱中过夜，37℃复温，SP二步法孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固，镜下观察BMP-2、DCN与BFGF染色情况。利用显微镜图像分析软件Image-Pro Plus，计算平均灰度值，分析免疫组织化学检测结果，以棕褐色为阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以（n，%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者骨不连发生率比较

2 型糖尿病组骨不连发生率高于非糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 2 组患者骨不连发生率比较（n，%）

2.2 2 组患者骨愈合质量比较

2 型糖尿病组Lane-Sandhu X线评分低于非糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 2 组患者Lane-Sandhu X线评分比较（±s，分）

表2 2 组患者Lane-Sandhu X线评分比较（±s，分）

组别 例数 最低得分 最高得分 平均得分2 型糖尿病组 27 0 7 5·22±0·74非糖尿病组 33 3 8 6·83±0·71 t 8·574 P 0·000

2.3 2 组患者骨组织形态学比较

骨组织学检查结果显示，11 例2 型糖尿病骨不连患者的断端中心与外周的组织成分均为纤维瘢痕组织，2 例有极少量的编织骨，1 例可见新生血管。倍镜下观察新生血管周围为长梭形成纤维样细胞，细胞通常带有2 个分支样突起，细胞核位于胞体中央呈椭圆形，胞质内可见大量粗面内质网与基质小泡。4 例非糖尿病骨不连患者的断端中心组织成分主要为纤维瘢痕组织，3 例断端边缘组织除可见纤维性骨化外，还有一定量的成骨细胞与新生血管。骨断端边缘与骨痂区之间可见管道样的缝隙连接，连接处细胞细胞器丰富，细胞膜有绒毛样突起。成骨细胞的胞体与胞核均呈卵圆形，可见有丝分裂，周围有大量胶原纤维。

2.4 2 组患者成骨活性比较

2 型糖尿病组骨生长因子BMP-2、DCN与BFGF免疫组化染色的阳性率均低于非糖尿病组，且镜下观察多数阳性细胞的细胞质染色浅于非糖尿病组；经Image-Pro Plus软件计算，2 型糖尿病组骨生长因子BMP-2、DCN与BFGF的平均灰度值均低于非糖尿病组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、表4。

表3 2 组患者BMP-2、DCN与BFGF免疫组织化学检测染色结果比较（n，%）

表4 2 组患者BMP-2、DCN与BFGF的平均灰度值比较（±s）

表4 2 组患者BMP-2、DCN与BFGF的平均灰度值比较（±s）

组别 例数 BMP-2 DCN BFGF 2 型糖尿病组 11 128·27±9·61 105·74±10·32 133·72±6·85非糖尿病组 4 155·84±8·50 162·80±11·73 176·20±6·63 t 5·042 12·113 14·779 0·000 0·000 0·000 P

3 讨论

糖尿病患者骨折不易愈合可能与成骨活性的差异性有关。研究表明，糖尿病患者的骨组织中成骨细胞数量减少、成骨速率降低，同时骨质疏松程度增加，这些因素都可能影响骨折愈合的过程。糖尿病患者的高血糖状态会影响成骨细胞的生长、分化和功能，从而导致骨代谢异常。此外，糖尿病患者常伴随着慢性炎症和氧化应激反应的增加，这些因素也可能进一步影响骨折愈合过程中成骨活性的差异性。

骨组织修复能力强大，经过适当治疗一般可在3个月内愈合，但部分患者由于多种原因超过9 个月骨折依旧不愈合，称骨不连，根据文献报道，骨不连发生率约为5%～10%[4]。本研究纳入的老年胫骨中下段骨折病例，该位置由于解剖特点，周围软组织少，骨骼末端血液循环较差，发生骨折后易出现局部血液循环障碍，加之老年患者生理机能减退，多伴全身疾病或营养不佳，局部抵抗力差，因此老年人是骨不连的高发群体。

糖尿病是老年人常见基础疾病，被认为是导致骨折不愈合的独立危险因素。糖尿病患者的骨折发生率和骨不连愈合率均较非糖尿病患者高。具体而言，糖尿病患者骨折发生率比非糖尿病患者高出1.3倍到1.7 倍，而且骨折类型多样，包括腰椎、髋部、手部和足部骨折等。据研究显示，糖尿病患者的骨不连愈合率可达30%～40%，而非糖尿病患者的骨不连愈合率则约为5%～10%。且研究认为，糖尿病患者的骨不连发生率高可能与多种因素有关，如高血糖、血管病变、神经病变、骨代谢紊乱等[5]。本研究结果显示，合并2 型糖尿病的老年胫骨中下段骨折患者骨不连发生率达40.74%，明显高于非糖尿病患者（P＜0.05）。以往关于糖尿病引起骨不连主要围绕血液循环展开研究，学者们认为糖尿病会引起全身性血管病变，导致血管结构与功能异常，同时提高血液粘稠度，引起局部血循环障碍，造成组织供血减少，减慢骨折愈合[6]。因此，针对糖尿病患者骨折不易愈合的问题，应该重视糖尿病对骨代谢的影响，针对不同阶段的骨代谢异常给予合适的治疗，如控制血糖、减少慢性炎症反应等，从而提高骨折愈合的成功率。

通过检测BMP-2、DCN和BFGF生长因子的水平，不仅可评估治疗糖尿病骨不连的效果。同时一些治疗方法还可以增加BMP-2、DCN和BFGF的水平，促进骨组织的生长和修复，从而改善骨不连的症状和预后。检测糖尿病骨不连患者的BMP-2、DCN和BFGF水平具有重要的临床意义。本研究从组织学角度出发，探究糖尿病与非糖尿病骨不连患者断端组织的成骨活性，发现2 型糖尿病患者Lane-Sandhu X线评分低于非糖尿病患者，骨生长因子BMP-2、DCN与BFGF阳性率低且细胞质染色浅于非糖尿病患者，组间差异有统计学意义（P＜0.05），表明2 型糖尿病患者成骨质量差，骨不连断端骨活性更低。糖尿病患者的骨不连通常是由于高血糖导致的骨细胞功能异常所致。BMP-2、DCN和BFGF是与骨细胞功能密切相关的分子。其中，BMP-2 为转化生长因子-β超家族成员，是一种骨形态发生蛋白，能够促进骨细胞增殖和分化，是促骨形成与诱导成骨细胞分化的重要细胞外信号分子，参与骨形成各个阶段，可以直接作用于成熟的破骨细胞来诱导其骨吸收活性，经多项体内外实验证明具有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力。研究表明，BMP-2 可以促进糖尿病患者的骨愈合，因为它能够恢复糖尿病患者骨细胞的功能，增加骨形成和骨量[7]。DCN为蛋白多糖家族成员，具有调节机制重构、抗凋亡、抗炎、抗黏附等作用，被认为是调节BMP的诱导信号，可以控制成骨细胞分化，与BMP-2 在促进骨形成方面发挥协同作用。且DCN是一种天然存在于骨基质中的蛋白，也参与骨细胞的增殖和分化。研究表明，在糖尿病骨不连患者中，DCN的表达量通常降低，导致骨的形成减少。因此，通过增加DCN的表达量，可以促进糖尿病骨不连患者的骨愈合[8]。BFGF是一种基础成纤维细胞生长因子，则可以促进内皮细胞游走与平滑肌细胞增殖，对于骨折创伤修复中细胞增殖分化、肉芽形成、组织重建等均具有促进作用。

本文结果显示，经Image-Pro Plus软件计算，2 型糖尿病组骨生长因子BMP-2、DCN与BFGF的平均灰度值均低于非糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05），研究表明，BMP-2、DCN和BFGF等成骨生长因子在促进糖尿病骨不连患者骨愈合中起到了积极的作用。平均灰度值是一种用于衡量数字图像中灰度级别的参数，通常用于评估组织或细胞内特定成分的含量或表达。因此，这3 种成骨生长因子在糖尿病骨不连患者的平均灰度值也是一种常用的评价指标。然而，需要注意的是，平均灰度值受多种因素的影响，如组织或细胞类型、数字图像采集条件、图像处理方式等，因此在不同的研究中可能会存在差异。此外，不同的研究可能会选择不同的成骨生长因子测量方法，也会对平均灰度值的结果产生影响[9]。

本研究中，骨组织形态学检查发现2 型糖尿病患者骨不连区域镜下可见大量陈旧性纤维组织，主要成分为质地坚硬的纤维瘢痕，血液供应差，成骨能力低，BMP-2、DCN与BFGF免疫组化染色以阴性为主，含量明显低于非糖尿病患者，考虑2 型糖尿病患者骨不连断端组织中骨生长因子缺乏，骨细胞活性低，导致纤维肉芽组织间质细胞转化为成纤维细胞，骨再生停止[10]。不过目前尚不明确2 型糖尿病患者骨折断端BMP-2、DCN与BFGF低表达的原因与机制，不过鉴于不连区域骨生长因子缺乏导致是导致骨折愈合能力下降的主要生物因素，外源性予以2型糖尿病骨折患者骨不连区域成骨因子，有可能提高患者骨不连组织的成骨能力，促进骨愈合，但具体结论有待扩展病例进一步验证。

综上所述，合并糖尿病的骨折患者断端组织成骨活性不高，易发生骨不连，成骨质量差，可能与骨不连断端组织BMP-2、DCN与BFGF表达低有关，辅以骨生长因子诱导成骨，有望提高糖尿病患者的骨折愈合质量，预防和减少骨不连的发生，促进早期康复。