ITP患者PD-1/PD-L1表达特点及其在Treg与Breg细胞之间的相互作用机制分析*

许腾 崔彦杰 李智伟 刘红春 郝立君

(新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心,新疆 乌鲁木齐 830001)

原发性免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种主要由免疫介导的血小板破坏和血小板生成障碍性疾病[1-2]。瘀点是ITP主要的临床表现,严重者可以出现内脏甚至颅内出血,出血的风险随着年龄的增长而增加[3]。ITP的发病机制,包括免疫、遗传和环境因素等,体内自身抗体和血小板抗原结合形成免疫复合物,单核巨噬细胞系统的Fc受体与自身抗体的Fc段结合,介导巨噬细胞吞噬和血小板破坏是ITP的典型发病机制[4-5]。然而,越来越多的研究表明[6-8],调节性Treg细胞和Breg细胞的免疫缺陷(包括数量减少和/或免疫抑制功能减弱),可能是导致机体对血小板抗原失去免疫耐受性从而造成ITP的重要发病机制。

程序性细胞死亡蛋白-1(Programmed cell death receptor-1,PD-1)属于CD28/B7家族,是一种重要的负调节因子,主要在活化的T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)和Treg细胞表面表达。程序性细胞死亡蛋白配体-1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)是PD-1的配体,主要在活化的Breg细胞上广泛表达,对抑制炎症和预防自身免疫性疾病方面有重要作用[9]。而Treg细胞和Breg细胞均是具有独特免疫调节作用的免疫细胞亚群,可通过分泌IL-4、IL-10及TGF-β等多种细胞因子,使ITP患者机体内免疫系统发生平衡偏移,进而促进抑制性细胞因子的分泌等作用,维持外周免疫耐受,可参与多种变态反应性疾病及肿瘤免疫的发病[10]。已知PD-1/PD-L1信号通路激活可以增加T细胞凋亡,抑制T细胞活化和增殖以维持免疫耐受。而在ITP患者中检测出PD-1和PD-L1低表达[11]。因此,PD-1/PD-L1信号通路在ITP的发病机制中可能具有重要作用。本研究旨在探索ITP患者中PD-1和PD-L1表达特点,以及PD-1/PD-L1信号通路调节Treg细胞和Breg细胞的可能潜在机制,以期为ITP临床治疗方向提供有价值的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年12月—2022年1月在我院治疗的ITP患者106例作为观察组。纳入标准：①诊断符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[12]中的标准。②年龄≥18岁。③疾病分期均为新诊断ITP。④患者及家属知情同意。排除标准：①入院前已接受过血小板输注、丙种球蛋白、激素等治疗。②合并有急慢性感染、系统性红斑狼疮、恶性肿瘤等其他疾病。③继发性血小板减少症。同时选取同期健康志愿者100例作为对照组。

1.2 方法

采取ITP患者和健康人群空腹血7 mL,其中2 mL乙二胺四乙酸(EDTA)进行抗凝,1 mL用于Breg细胞和Treg细胞检测,1 mL用于检测PD-1、sPD-1和PD-L1,5 mL血2000 r/min低温离心10 min,收集血清后立即储存于-80 ℃冰箱,用于检测TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17。

1.2.1 流式细胞术检测Breg细胞和Treg细胞 Breg细胞检测管吸取100 uL全血,然后依次加入FITC标记的CD38、PE标记的CD19和PerCP标记的CD45各20 uL,APC标记的CD245 uL。Treg细胞检测管吸取100 uL全血,然后依次加入FITC标记的CD4、PE标记的CD127和PerCP标记的CD3各20 uL,APC标记的CD255 uL。将检测管避光放置15 min后加入2 mL红细胞裂解液,溶血10 min后离心去上清液,再加入2 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤离心去上清液,加入500 uL PBS重悬。使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德国)进行检测,使用FlowJo10.5分析检测数据,计算Breg细胞占CD19+细胞的百分比和Treg细胞占CD4+细胞的百分比。

1.2.2 流式细胞术检测PD-1 使用APC标记的CD3,Percp标记的CD4,FITC标记的CD8和PE标记的PD-1单克隆抗体。对于PD-L1检测,使用PerCp标记的CD11c,PE标记的PD-L1和PE-cy7标记的HLA-DR单克隆抗体。将样品在室温下在黑暗中孵育15 min,然后用PBS洗涤2次,重悬,并在MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德国)上进行分析。流式细胞仪提供的MACSQuant软件用于数据分析。

1.2.3 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测sPD-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17 取出储存于-80 ℃冰箱的血样本,将50 uL稀释的标准样品和待测样品依次加入每个孔中,然后加入50 uL生物素标记的抗体。在37 ℃孵育1 h后,用磷酸盐缓冲液吐温-20(PBST)洗涤孔3次。之后,加入80 uL亲和链霉素-HRP并在37 ℃下孵育30 min。用PBST洗涤3次后,将底物A和B各50 uL加入反应孔中,并在37 ℃下孵育10 min。然后通过加入50 uL终止液停止反应。用酶标仪测量OD 450值。sPD-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17抗体购自abcam公司。酶标仪为美国Molecu-lar公司SPECTCA MAX190。

1.3 病情程度判断 轻度患者：血小板(PLT)≥50×109/L;中度患者：30×109/L≤PLT<50×109/L;重度患者：PLT<30×109/L[11]。本次研究ITP轻度患者32例,中度患者44例,重度患者30例。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、BMI一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组Treg细胞百分比、Breg细胞百分比等比较 观察组Breg细胞百分比、Treg细胞百分比、TGF-b、IL-10和IL-4水平明显低于对照组(P<0.05);观察组Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率、sPD-1和IL-17水平明显高于对照组(P<0.05);两组sPD-L1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组Treg细胞百分比、Breg细胞百分比等比较

2.3 观察组不同病情患者Treg细胞百分比、Breg细胞百分比等比较 观察组重度患者Breg细胞百分比、Treg细胞百分比明显低于轻度和中度患者(P<0.05),而Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率明显高于轻度和中度患者(P<0.05);观察组中度患者Breg细胞百分比、Treg细胞百分比明显低于轻度患者(P<0.05),而Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率明显高于轻度患者(P<0.05);观察组不同病情患者TGF-β、sPD-1、sPD-L1、IL-10、IL-4和IL-17水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 观察组不同病情患者Treg细胞百分比、Breg细胞百分比等比较

2.4 相关性分析 将Breg细胞百分比、Treg细胞百分比等指标进行相关分析,结果显示,Treg细胞表面PD-1阳性率与Breg细胞表面PD-L1阳性率呈正相关(r=0.466,P<0.05),见图1。

图1 相关分析图

2.5 观察组治疗前后Treg细胞百分比、Breg细胞百分比等比较 与治疗前相比,观察组治疗后Breg细胞百分比、Treg细胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平有所升高(P<0.05),而Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率、sPD-1和IL-17水平有所降低(P<0.05),治疗前后 sPD-L1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 观察组治疗前后Treg细胞百分比、Breg细胞百分比等比较

3 讨论

ITP的发病主要集中于欧美地区,且可发生于任何年龄段,儿童期及老年期为ITP发病的高峰期[13]。ITP是由机体免疫失衡引起的自身免疫性疾病,包括免疫介导的血小板破坏,伴有不同程度的出血[14]。ITP的发生机制多样复杂,涉及多个方面。在ITP的免疫发病机制中,T细胞仍处于中心阶段,在抗血小板自身免疫的启动、传递和维持中起着重要作用[15]。T细胞需要双信号才能激活：T细胞抗原受体特异性识别抗原呈递细胞呈递的抗原肽,并为T细胞活化提供第一信号;然后,相应的受体与抗原呈递细胞上的共刺激分子结合,提供第二激活信号。此外,T细胞活化过程中还存在负反馈调节机制,PD1/PD-L1通路即其中之一[16]。PD-1/PD-L1通路的慢性刺激可导致效应T细胞耗竭和功能障碍,防止过度免疫损伤,对维持信号通路免疫稳态起重要的调节作用[17]。PD-1/PD-L1信号通路在ITP、多发性硬化、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用[18]。

Treg是CD4+T细胞的一个特殊亚群,可通过抑制免疫系统的激活,从而维持体内平衡和对自身抗原的耐受性,并在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用[19]。Breg细胞是一种特殊的B细胞亚群,可以促进CD4+CD25-T细胞转化为Treg细胞,并促进其分化[20]。Treg细胞和Breg细胞可以细胞之间的直接相互作用和细胞因子(如IL-10和TGF-β)的产生来抑制CD4+T细胞或CD8+T细胞的活化和增殖,并通过与效应T细胞和单核细胞的直接相互作用发挥调节作用[21-22]。免疫应答失衡和免疫耐受性丧失,在ITP的发病机制中也起重要作用[23]。辅助性T细胞(Th)亚群协调不同的免疫应答并介导不同细胞因子(IL-4)的活性,异常的Th细胞活性可能导致慢性炎症和自身免疫性疾病[24]。本研究结果显示,ITP患者治疗后Breg细胞百分比、Treg细胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平均有所升高(P<0.05),提示Breg细胞、Treg细胞数量及其异常功能等细胞免疫紊乱是ITP的重要机制。考虑Breg细胞、Treg细胞明显减少,使得分泌IL-10和TGF-β减少,从而减弱了对CD4+T细胞或CD8+T细胞的活化和增殖的抑制作用,破坏了Th1/Th2和CD4+/CD8+平衡状态,同时减少了Treg细胞的产生,使机体免疫耐受机制减弱[25]。本研究发现,观察组Breg细胞百分比、Treg细胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平均明显降低(P<0.05),且Breg细胞百分比、Treg细胞百分比的降低程度与ITP的严重程度呈正比(P<0.05)。

PD-1/PD-L1信号通路的激活抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生,在调节免疫平衡和维持外周免疫耐受中起重要作用。PD-1和PD-L1有两种形式,即分泌形式(sPD-1和sPD-L1)和膜结合形式[26]。可溶性程序性细胞死亡蛋白-1(sPD-1)是通过细胞膜表面PD-1磷酸水解获得的PD-1的可溶性形式,在免疫相关性疾病中高表达,被认为会阻断PD-1/PD-L1信号通路[27]。而可溶性程序性细胞死亡蛋白配体-1(sPD-L1)可以通过保留IgV结构域来刺激PD-1,并能促进PD-1/PD-L1信号通路,从而抑制T细胞增殖和活化[28-29]。由Th17细胞分泌的IL-17,作用于不同的靶细胞,触发炎症介质的释放,介导炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应等疾病的发生[30-31]。本研究发现,观察组Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率、sPD-1和IL-17水平均明显升高(P<0.05),sPD-L1水平变化未见明显差异(P>0.05)。Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率与ITP的严重程度呈正比。Treg细胞表面PD-1阳性率与Breg细胞表面PD-L1阳性率呈正相关。ITP患者治疗后Treg细胞表面PD-1阳性率、Breg细胞表面PD-L1阳性率、sPD-1和IL-17水平降低(P<0.05),治疗前后sPD-L1水平变化未见明显差异(P>0.05)。提示PD-1/PD-L1信号通路及免疫应答失衡是ITP发生发展的重要机制。考虑sPD-1的产生增加,促进了PD-1/PD-L1信号通路的阻断。虽然Treg细胞和Breg细胞表面的PD-1/PD-L1阳性率增加,但IL-17水平仍然升高,加强作用于不同的靶细胞,触发炎症介质的释放,因此PD-1/PD-L1通路被有效阻断,使T细胞过度增殖活化和促进细胞因子的产生,从而造成机体免疫耐受减弱和免疫应答失衡。

4 结论

ITP患者Treg细胞表面PD-1和 Breg细胞表面PD-L1阳性率明显升高,与患者病情严重程度呈正相关,同时Treg细胞表面PD-1和 Breg细胞表面PD-L1表达之间存在相关性,可进一步研究。