没食子酸抑制人舌鳞癌SCC-9细胞增殖、凋亡及可能机制研究*

海乐 易必新 潘小红

(1.湖南省药品审核查验中心, 湖南 长沙 410000;2.湖南省药品检验研究院, 湖南 长沙 410000)

口腔颌面部恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的3%～5%,组织病理学类型多样,以鳞状细胞癌最多见,属于世界范围内第六大常见的恶性肿瘤,其发生与多种内、外因素有关,尤以吸烟、饮酒的危险性最大[1]。口腔颌面部恶性肿瘤的治疗以手术为主,但预后效果欠佳,复发转移率较高,放化疗效果也不理想[2]。因此,寻找一种对肿瘤敏感性高、不良反应少、疗效好的药物是亟待解决的问题。一般认为肿瘤的发生不仅与分化异常有关,与细胞凋亡机制也有密切关系[3]。没食子酸(Gallic acid,GA)是一类多酚类化合物[4],可通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡在人肿瘤细胞系中发挥抗肿瘤作用,在药理学方面具有安全性和高效性,已成为肿瘤预防及治疗领域的热点之一。迄今为止,GA对人口腔癌SCC-9细胞的影响少见报道,本研究观察没食子酸对SCC-9细胞增殖及凋亡的影响,探讨其可能机制,为进一步阐明没食子酸的抗肿瘤机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 没食子酸购自Sigma公司,SCC-9人舌鳞癌细胞株来自中国科学院上海细胞所,噻唑蓝(MTT)购自北京索来宝科技有限公司,膜联蛋白V(Annxin V)/碘化丙锭(propidium iodide,PI)凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司,细胞裂解液和BCA蛋白含量测定试剂购自江苏碧云天公司,鼠抗人Cleaved-PARP、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8和Cleaved-caspase3一抗购自abcam公司,鼠抗人p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养及分组 将SCC-9人舌鳞癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养,收集对数生长期细胞进行实验。细胞贴壁后,将细胞分为4组：对照组、低浓度没食子酸组(30 μM GA组)、中浓度没食子酸组(60 μM GA组)、高浓度没食子酸组(90 μM GA组)。

1.3 MTT检测细胞增殖 将SCC-9细胞以密度为5×104个细胞/孔,接种于24孔培养板上过夜,加入含没食子酸(0、30、60和90 μM)培养液37 ℃下分别培养24和48 h,然后按照MTT试剂盒说明书进行操作,并使用酶标仪在563 nm处测量每个孔的吸光度。

1.4 流式细胞仪检测SCC-9细胞周期 SCC-9细胞同“1.3方法”接种在培养皿上,并与没食子酸(30、60和90 μM)共孵育24 h,收集细胞、重悬,4 ℃固定24 h 后离心去除固定液,在室温下加入嗅化乙锭(PI)溶液避光染色15 min,使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.5 流式细胞仪检测SCC-9细胞凋亡率 将SCC-9细胞同“1.3方法”接种到24孔板,待细胞贴壁后将细胞分组,按照FITC Annexin V凋亡检测试剂盒说明书进行操作,SCC-9细胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染色,混合液置于暗处室温反应15 min,然后加入400 μLAnnexin V-结合缓冲液重悬1 h后,采用流式细胞仪进行细胞分析。

1.6 TUNEL法检测SCC-9细胞凋亡 SCC-9细胞培养及分组同“1.3方法”,按照TUNEL法检测试剂盒说明进行操作,在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养48 h后进行检测,显微镜下观察凋亡阳性细胞。

1.7 Western blot检测SCC-9细胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表达 收集各组SCC-9细胞,裂解后BCA试剂盒检测总蛋白浓度。电泳分离,PVDF膜转膜、封闭,加入一抗,4 ℃轻摇过夜,再加入HRP标记的二抗孵育2 h、显色,采用凝胶成像技术进行分析。

2 结果

2.1 没食子酸抑制人口腔癌SCC-9细胞增殖 培养24、48 h后,与对照组比较,低、中和高浓度没食子酸组SCC-9细胞增殖率逐渐下降,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1。

图1 MTT检测SCC-9细胞增殖

2.2 没食子酸诱导人口腔癌SCC-9细胞sub G1细胞周期阻滞 使用流式细胞仪对碘化丙啶(PI)染色后的细胞进行定量分析,与对照组比较,没食子酸组SCC-9细胞的sub G1期DNA含量逐渐增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图2。

图2 没食子酸对SCC-9细胞周期的影响

2.3 没食子酸诱导SCC-9细胞凋亡 与对照组比较,低、中和高浓度没食子酸组细胞晚期凋亡率逐渐增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图3。

图3 没食子酸对SCC-9细胞凋亡的影响

2.4 4组SCC-9细胞凋亡情况比较 与对照组比较,低、中和高浓度没食子酸组阳性细胞凋亡数逐渐增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图4。

图4 TUNEL法检测各组SCC-9细胞凋亡

2.5 没食子酸诱导SCC-9细胞中Caspase活化及PARP的裂解 与对照组比较,中、高浓度食子酸组SCC-9细胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表达增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图5A。与对照组比较,低、中和高浓度没食子酸组SCC-9细胞中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表达增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图5B。

图5 没食子酸对SCC-9细胞中凋亡及MAPK信号通路的影响

3 讨论

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主、有序死亡,也是机体清除不必要受损细胞的一种病理生理过程[5-6],因此凋亡可作为肿瘤治疗的一种治疗策略。没食子酸(GA)是一种天然多酚类化合物,具有多种生物学活性,如抗炎、抗氧化等作用[7],还能选择性抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[8]。但目前关于GA对口腔癌作用的具体机制尚不完全清楚,并且缺乏多种药理作用之间相关性研究。

本研究MTT检测结果显示,相同作用时间下,随着GA浓度增加,SCC-9细胞的增殖率逐渐下降,具有药物浓度相关性;而相同作用浓度下,48 h作用时间的SCC-9细胞增殖率低于24 h,说明其抑制效果具有时间相关性。流式细胞仪和TUNEL检测结果提示,GA参与了细胞凋亡调控,药物浓度的增加能诱导SCC-9细胞sub、G1细胞周期阻滞,从而晚期凋亡率逐渐增加、抑制其增殖,且凋亡具有浓度依赖性。

Caspases蛋白酶激活级联反应在凋亡各个阶段发挥重要作用[9]。细胞内凋亡信号转导涉及两条基本途径：外源性通路和内源性通路[10]。外源性凋亡信号可诱导形成死亡诱导信号复合物,激活细胞膜近端的Caspase-8等,然后剪切活化执行型Caspase(如Caspase-3),同时活化的Caspase-8还可以剪切活化PARP,进而诱导细胞凋亡[11];内源性通路也称为线粒体途径,线粒体膜电位变化和线粒体内外膜通透性增加引导释放细胞色素C,随后与胞浆中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)结合,激活Caspase-9,启动caspase级联反应,诱导细胞凋亡[12]。PARP是真核细胞中的DNA修复酶,可识别结构损伤的片段DNA[13]。Caspase-3一旦被激活,即可诱导PARP发生断裂,使细胞进入凋亡途径[14]。Western blot检测发现,与对照组比较,中、高浓度没食子酸组SCC-9细胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表达增加,提示没食子酸可能通过细胞外传导途径活化Caspase-8,进一步激活下游效应因子Caspase-3,诱导细胞凋亡;没食子酸还可能通过线粒体途径,促进凋亡刺激因子与Apaf-1形成多聚复合物,激活Caspase-9,进而激活下游的 Caspase-3,诱导PARP发生剪切,进入凋亡途径。

MAPK是一丝席氨酸蛋白激酶家族,p38、ERK 1/2、JNK是MAPK家族的主要成员,其中JNK、p38 MAPK 信号通路活化与细胞凋亡有关[15]。研究表明,活化的MAPK通过级联反应将外界信号传递给细胞核,调节细胞增殖、迁移、分化和凋亡[16-17]。文献报道[18],人肝癌和早幼粒细胞白血病细胞中,甘草黄酮通过JNK1/2途径激活Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3导致细胞凋亡;ERK 1/2级联是一种经典的细胞内信号通路,ERKl/2磷酸化是功能活动的标志,能介导细胞的增殖、分化和死亡多种病理生理过程[19-20]。Western blot检测发现,没食子酸组p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表达较对照组逐渐增加(P<0.05),提示没食子酸可能通过磷酸化JNK、p38、ERK1/2途径激活下游信号因子Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3,发挥促进SCC-9细胞凋亡、抑制其增殖的作用,这与本研究MTT结果基本一致。

4 结论

没食子酸具有抑制SCC-9细胞增殖、诱导凋亡作用,这与其可以通过激活MAPK/ERK信号通路,活化下游Caspase信号因子,诱导PARP发生断裂,促使细胞进入凋亡途径有关,提示没食子酸可作为一种潜在的口腔癌治疗剂。